DNA烷基化损伤及其修复研究进展

田永峰，侯宏卫，张小涛，刘勇，胡清源，王安

1 中国科学院安徽光学精密机 械研究所，合肥 230031；

2 国家烟草质量监督检验中心，郑州高新区枫杨街2号 450001

综述

DNA烷基化损伤及其修复研究进展

田永峰1，2，侯宏卫2，张小涛1，2，刘勇1，胡清源2，王安1

1 中国科学院安徽光学精密机 械研究所，合肥 230031；

2 国家烟草质量监督检验中心，郑州高新区枫杨街2号 450001

DNA的烷基化损伤可导致复制过程中的错配，被认为是引起基因突变及相关疾病的原因。烷基化DNA加合物是重要的DNA烷基化损伤产物。本文介绍了DNA烷基化损伤的修复机制以及产物；综述了烷化类损伤试剂，及其作用于细胞产生烷基化DNA加合物的机理；讨论了烷化类DNA加合 物与吸烟之间的关系；综述了烷化类D NA加合物的检测方法；展望了烷基化DNA加合物的研究方向及作为烷基化损伤标志物的研究前景。

DNA烷基化损伤；烷基化DNA加合物；DNA烷基化损伤修复

DNA是生命的遗传物质。环境中存在的辐射，内源物质和外源物质这些都可以导致DNA的烷基化损伤（DNA中引入烷基的反应，如甲基、乙基等），如环境中的亚硝酸盐（亚硝基脲，亚硝基胍，烟草中特有的亚硝胺），抗癌药物链脲霉素、替莫唑胺等[1]。烷化剂与DNA碱基主要的反应位点有鸟嘌呤的N3、O6、N7位，腺嘌呤的N1、N3、N7位，胸腺嘧啶 /尿嘧啶的 O2、O4、N3位和胞嘧啶的O2、N3位，分别形成烷基化鸟嘌呤（N3-alkylguanines；N7-alkylguanines；O6-alkylguanines）、烷基化腺嘌呤（N1-alkyladenines；N3-alkyladenines；N7-alkyladenines）、烷基化胸腺嘧啶（O2-alkylthymines；O4-alkylthymines；N3-alkylthymines）和烷基化胞嘧啶（O2-alkylcytosines；N3-alkylcytosines）[2-4]（图1）。这些烷基化的碱基在DNA复制的过程中可使基因所携带的遗传信息发生改变，这可能是引起相关疾病的原因。

图1 烷化类DNA加合物[5]Fig.1 Alkylation DNA adducts

1 卷烟烟气中重要的烷基化DNA加合物

环境中存在大量的烷化剂，有代谢过程中产生的体内烷化剂，也有环境、食物、饮用水等中存在的外部烷化剂。烷化类试剂在生物体内活化同时产生烷基自由基，烷基自由基可以和DNA碱基的氧原子和氮原子发生反应生成烷基化DNA加合物。DNA的烷基化过程是由烷化剂、DNA/RNA的空间结构以及碱基在DNA/RNA的双链、单链中的位置等因素共同作用决定的[6-9]。烷化剂的诱变机制分为单分子的SN1机制和双分子作用的SN2机制，典型SN1机制烷化剂为N-甲基-N-亚硝基脲（N-methyl-N-nitrosourea， MNU），SN2机制的代表烷化剂为甲烷磺酸甲酯（methyl methanesulfonate，MMS）。SN1机制作用下的烷化类试剂在诱导DNA碱基发生烷基化的过程 中作用于碱基中的氮原子和氧原子，形成O-烷基化加合物（O-alkylations）和N-烷基化加合物（N-alkylations）。SN2作用机制的烷基化类试剂则作用于碱基上的氮原子，生成N-alkylations。碱基中氧原子位置形成的烷基化碱基既有基因毒性又有突变性。如O-alkylations具有很强的致突变性和基因毒性。而氮原子位置形成的N-alkylations则具有很强的细胞毒性，但是致突变性较低。如细胞发生烷化类的DNA损伤时，可检测到N7-烷化鸟嘌呤（N7-alkylguanine），其本身是无毒害作用的，但是由于在DNA的序列中鸟嘌呤发生了烷基化，在脱烷基化修复的过程中，则产生了很多具有细胞毒性的位点[10-12]。

卷烟烟气中特有亚硝胺NNK等可以通过主流烟气进入吸烟者体内。在细胞色素酶P450参与下，NNK会发生α位的羟基化，羟基化会导致NNK中的甲基亚硝基成为活性基团并释放出烷基自由基。吸烟者接触的烷基自由基包括：卷烟主流烟气中的烷基自由基、NNK在生物体内代谢活化产生的烷基自由基、日常饮食及环境中包含的烷基自由基。这些烷基自由基可与DNA碱基发生反应生成烷化类的DNA加合物。卷烟烟气中NNK与吸烟者体内的烷基化DNA加合物关系如图2所示[13-15]。为评估烟气中烷化类试剂暴露导致的烷化类损伤风险，烷化类的DNA加合物就成为了潜在的很好的生物标志物。此外，烷基化DNA加合物与烷化剂的关系也需要更进一步研究，特别是卷烟烟气中存在的特有亚硝胺以复杂体系的形式与生物体接触。对于复杂体系中的烷化剂对于细胞的作用目前还存在争议，需深入研究。同时在烷基化DNA加合物参与的DNA复制中产生的无嘌呤位点，以及DNA糖基化酶修复烷基化DNA加合物后产生的无嘌呤位点的致突变性和细胞毒性也需要深入研究。

图2 卷烟烟气中NNK诱导DNA烷基化Fig.2 NNK-induced DNA alkylation in the smoke

2 吸烟导致的DNA烷基化损伤

DNA烷基化损伤的主要产物是O6-甲基鸟嘌呤（O6-MeG），N3-甲基腺嘌呤（N3-MeA），N7-甲基鸟嘌呤（N7-MeG）。O6-MeG具有致突变性和细胞毒性，又是烷基化损伤中产生的主要加合物，因此得到广泛研究[16]。N3-MeA的体内含量低于O6-MeG，每天大约会产生600个[17]。N3-MeA的致突变性较低，但是可以阻止DNA的复制，因此具有较强的细胞毒性[18]。鸟嘌呤的N7原子是所有的碱基中最容易发生化学反应的位点，极易与烷化剂发生反应生成N7-MeG[19]。当DNA暴露于环境中烷化剂时，SN1机制试剂有67%的几率；SN2机制试剂有82%的几率与鸟嘌呤的N7位发生反应生成N7-MeG[20]。人类DNA每天大约可以产生4000个N7-MeG[17]。N7-MeG没有明显的致突变性和细胞毒性。但是N7-MeG会影响DNA复制过程中的N7原子位置的氢键形成，从而在复制过程中造成了无嘌呤位点[21]。

Loechler等在研究单链DNA M13mp8中的O6-MeG发现其主要的致突变性是在DNA复制过程中可导致G-A的突变[22]。在对M13mp7基因的研究中发现，不同的修复机制作用下，O6-MeG可导致大肠杆菌发生10%-100%的突变[23]。Ziegel等利用NNK对人类原癌基因K-ras进行暴露，检测到烷基化DNA加合物7-甲基鸟嘌呤（N7-MeG）；O6-甲基脱氧鸟嘌呤（O6-MedG）；O6-吡啶基脱氧鸟嘌呤（O6-POBdG）。并发现在K-ras基因鸟嘌呤的G3-G8位点上均可以发生烷基化，G5位点发生烷基化的概率要远远高于理论值。为研究DNA烷化类损伤与癌症的关系提供支持[24]。Cloutier 等利用烟气中特有亚硝胺4-（甲基亚硝胺基）-1-（3-吡啶）-1-丁酮（NNK）的前体物质4-（乙酰基羟基甲酯）-1-（3-吡啶）-1-丁酮（NNKOAc）对大肠杆菌进行暴露，检测到五种烷基化鸟嘌呤，但未检测到3-烷化腺嘌呤[25]。Hu等对吸烟者和非吸烟者体内白细胞中的N3-MeA，N7-MeG，8-羟基脱氧鸟苷，5-甲基胞嘧啶等标志物进行检测分析，发现N3-MeA和吸烟的生物标志物可替宁具有较强相关（r= 0.49），而对于N7-MeG的研究中却未发现与可替宁有强相关（r= 0.16）[26]。Mitchell 等利用亚硝基胍对人类TK6细胞进行暴露，对提取的DNA进行检测，发现含有N3-MeA，N7-MeG[11]。Thorne等将培养的NCI-H292人肺癌细胞暴露于主流烟气，利用彗星实验检测到大量的细胞的损伤和氧化损伤的DNA，但是未检测到烷化类损伤的DNA[27]。

Kopplin 等利用同位素内标结合高效液相色谱法（HPLC-UV），研究了5名吸烟者和5名非吸烟者尿液中3-甲基腺嘌呤（N3-MeA）和3-乙基腺嘌呤（N3-EtA），发现吸烟可导致尿液中的N3-MeA升高（吸烟者：13.6-14.8 µg/24 h，非吸烟者：4.7-6.2µg/24 h，P＜ 0.01）；尿液中的N3-EtA吸烟者比非吸烟者高5倍（吸烟者：119.3-138.5 ng/24 h，非吸烟者13.7-32.8 ng/24 h）。通过进一步考察吸烟者的饮食，发现饮食对于志愿者体内N3-MeA影响较大，结论认为吸烟对体内N3-EtA含量有影响。但是对于中国男性吸烟者的调查中却没有发现这个规律[28]。英国国际癌症研究中心的Prevost 等对4名吸烟者尿液中N3-MeA、N 3-EtA、N3-羟乙基腺嘌呤（N3-HOEtA）进行了研究，发现尿液中的N3-EtA释放量与抽吸卷烟数量和尿液中的可替宁含量高度相关（抽吸卷烟数量：r= 0.86，P＜ 0.01； 尿液中的可替宁含量：r=0.60，P＜ 0.01）；而轻度吸烟者（＜17 支/天）尿液中的N3-MeA区别不大，但中等吸烟者（10-32 支/天）尿液中的N3-MeA吸烟期间比不吸烟期间显著高，然而对于饮食控制人群，即使是低水平（＜ 11 支/天）的抽吸卷烟数量尿液中的3-烷化腺嘌呤也是随着卷烟数量的增加而增加的。得出结论吸烟可以导致体内N3-MeA和N3-EtA升高。但是未发现对N3-HOEtA有影响[29]。2006年，菲利浦莫里斯（Philip Morris Companies Inc.）美国研究中心，Feng 等利用LC-MSMS法对吸烟者尿液中1-羟基芘，N3-MeA，N3-EtA，8-羟基脱氧鸟苷等进行检测。结论认为N3-MeA只是在传统卷烟和不吸烟者之间有差别，而低焦卷烟中并未发现差别，N3-EtA的检测结果则出现了矛盾性，吸烟后尿液中的N3-EtA比吸烟前还要低[30]，其可能的原因是N3-EtA的生物半减期较短，导致了吸烟者体内的N3-EeA水平较低。2011年，Hu等利用LC-MSMS法对成年（40岁）吸烟者尿液中N3-MeA，N7-MeG进行检测。结果发现N3-MeA/肌酐比值与可替宁/肌酐比值存在相关性，相关系数0.69，而N7-MeG相关性不明显，由此认为N3-MeA是与吸烟相关的标志物[31]。

可见，烷化类DNA加合物是烟气暴露引起DNA烷基化损伤的重要生物标志物，但是体内的烷基化DNA加合物水平同样受饮食、环境接触等影响，所以有必要对烷基化腺嘌呤进行深入研究，系统建立评估生物体内烷化类DNA加合物的方法，用来评估环境中烷化剂暴露，尤其是烟气中的烷化剂对吸烟者体内烷化类腺嘌呤种类及含量水平产生的影响。

3 DNA的烷基化损伤修复机制

烷基化DNA加合物在3-甲基DNA烷基糖基化酶（AAG）；3-甲基腺嘌呤DNA糖基化酶Ι（TAG）;N-甲基嘌呤DNA糖基化酶（MPG）等的作用下，通过碱基切除修复（BER）机制和核酸切除修复机制（NER）进行修复，通过机体自身的脱碱基作用或者在糖基酶的作用下通过碱基切除修复机制从核苷酸链上切除并随尿液排出体外[32-34]。细胞内每天会发生20000个DNA片段的损伤，这些损伤都需要靠体内的修复机制进行修复。对于烷化类DNA加合物修复机制的研究表明，体内对于烷化类DNA加合物的低修复水平可导致患癌症的风险增加[35]。

因此检测吸烟人群尿液中烷基化DNA加合物作为研究卷烟烟气暴露导致的吸烟者体内烷化类损伤的非创伤性目标物，可用来评估体内DNA受到的烷基化损伤程度及可能的癌症风险。

4 烷基化腺嘌呤的检测技术

尿液中3-alkAde检测方法通常采用GC-MS法，如Prevost等人利用GC-MS法检测了尿液中3-烷化腺嘌呤[36]和吸烟者体内N3-MeA、N3-EtA[29]。该方法具有分离效率高、分析速度快等特点，但前处理繁琐，需要化学衍生化，灵敏度低，不能对3-烷化腺嘌呤直接定量分析等缺点。检测前需要对烷基化DNA加合物进行化学衍生化，增加了分析结果的不准确性。衍生化是利用特定的衍生化试剂与化合物之间发生化学反应使反应后的化合物与原化合物结构类似[37]，目的是要把难于分析的物质转化为与其化学结构相似易于分析的物质[38-40]，由于溶解度、沸点、熔点、聚集态或化学成分与原化合物不同[41]，衍生化过程中带来的样品损失难以准确定量，因此应用此法同时分析两种或以上烷基化DNA加合物并不理想。

32P标记法—免疫亲和性层析色谱搭配32P后标记技术（immunoaf finity chromatography/32P-postlabelling technique，IC-32P）是现今检测DNA加合物最为灵敏的方法，可以检测到1010分子中含有的一个DNA加合物，而且检测时只需要30-40μg的DNA样品。此方法是利用放射性同位素32P标记的三磷酸腺苷（ATP）与免疫亲和层析柱（immunoaf finity column）纯化后的DNA水解产物结合，产生32P标记的DNA加合物。32P标记的DNA加和物再经过聚乙烯亚胺纤维膜（polyethyleneimine cellulose）纯化，通过计算32P放射强度，可以得到DNA加合产物的含量[42-46]。

1982年，Gupta等[47]首次应用此法检测DNA中的多环芳烃，芳基胺和无放射性芳基胺，此法在当时用于检测大量的DNA加合物中的少量致癌物，并且这些致癌物既无放射性也没有特异性抗体。此后IC-32P就成为研究者研究有机体DNA损伤，检测致癌物的最灵敏方法。其检测的灵敏度可达到从109的数量级的分子中检测0-27个标志物[48]。1999年，Plan 等利用32P标记法，N7-MeG，1-羟丙基腺嘌呤等标志物，检出限达到0.3mol/109mol，检测所需样品10μg DNA[49]。

32P标记法虽然十分灵敏，且仪器简单，但步骤繁琐，在免疫亲和层析柱富集纯化样品的过程中会有微量的DNA样品的损失，并且缺乏适当的内标准物来准确定量。采用的不是标准化的仪器分析，在分析大量的生物样品的时候，人工操作对检测结果的影响不能忽视，并且在使用不同亲和性小柱的回收率会影响方法回收率。

为了提高灵敏度和专一性，Tavazzi等[50]采用HPLC-UV检测尿液中的N3-MeA，检出限为0.05µM。随着仪器的发展，由于液相色谱-串联质谱法（LC-MS/MS）高选择性与灵敏度，前处理过程简单，可同时检测多种目标物等优点在烷基化DNA加合物的检测分析过程中得到应用。LC-MS/MS用于同时测定尿液中的N3-MeA和N3-EtA，方法的检出限为 2.0 pg/mL，但所需样品体积大（50mL）[30]; Hu等[26]采用柱转换方法伴随在线固相萃取LC-MS/MS方法对尿液中的N3-MeA进行了测定，减少了样品的用量，进样量只需20 µL尿液，运行时间12 min，检出限为0.035 ng/mL。

综上所述，建立LC-MS/MS法同时检测多种烷基化DNA加合物的方法是当前研究烷基化DNA加合物的难点。由于烷基化DNA加合物种类繁多，体液基质复杂，烷基化DNA加合物含量低，生物半减期短，且具有较强的亲水性。因此目前商品化的C18柱对烷基化DNA加合物的分析并不是很适合。选择合适的极性色谱柱，配合分析灵敏度高且快速准确定量的三重四级杆质谱系统，建立同时分析多种烷基化DNA加合物的方法需要进行深入研究。

5 展望

烷基化DNA加合物在体内的含量很低，所以研究准确定量烷基化DNA加合物的检测方法将是今后发展的重要方向。一方面，随着近年来串联质谱与高效液相色谱技术联用技术的突破，利用LC-MS/MS技术同时检测多个烷基化DNA加合物的研究必将成为研究热点。另一方面，外源物质导致体内烷基化DNA加合物的产生的关联性以及产生烷基化DNA加合物的种类还需要深入地研究，目前外源物质导致的DNA烷基化损伤机理的研究不够全面，因此找到可以很好的评价DNA烷基化损伤程度的烷基化DNA标志物具有重要意义。目前的研究由于样本量小，结论存在分歧。另外，由于烷基化DNA加合物在尿液中的含量低，并且受到环境饮食等因素干扰，目前亟需建立一种简便、富集效率高、选择性好的可以同时测定尿液中烷化类加合物的方法，同时需要进行细胞，体液等全面研究，从而找出准确评价DNA烷基化损伤程度的DNA加合物。

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Research advances in DNA alkylation damage and repair

TIAN Yongfeng1，2,HOU Hongwei2,ZHANG Xiaotao1,2,LIU Yong1,HU Qingyuan2,WANG An1
1 Anhui Institutes of Optics and Fine Mechanics,Chinese Academy of Science,Hefei 230031,China；
2 China National Tobacco Quality Supervision and Test Center,Zhengzhou 450001,China

The fact that DNA alkylation damage might lead to mismatch in replication was considered as cause of g ene mutation and other relevant disease.The variety of DNA alkylation damage,repair mec hanisms and its products，the generative mechanism in vivo and analytical method of alkylation DNA adducts were reviewed.Current analytical methods of alkylation DNA adducts include Immunoaf finity Chromatography/32P-postlabelling technique (IC-32P),Gas Chromatogeraph-Mass Spectrometer (GC-MS) and Liquid Chromatography-tandem Mass Spectrometer (LC-MS/MS).IC-32P had excellent performance on sensibility,but it took many complicated steps in determining alkylation DNA adducts.The sample usually cost more in the method of GC-MS during pre-handling process as derivatization is needed; LC-MS/MS method offered many practical advantages in pre-handling such as stability,selectivity and sensibility,which can enhance the ef ficiency of sample analysis.As biomarkers of DNA alkylation damage,alkylation DNA adducts played a signi ficant role in risk evaluation of alkylation reagents.

DNA alkylation damage; DNA adducts; repair of DNA alkylation damage

10.3969/j.issn.1004-5708.2014.01.018

TS416

A

1004-5708（2014）01-0096-07

田永峰（1982—），博士研究生，研究方向为烟草化学和生物标志物，Email：yongfengtian@126.com

胡清源，研究员，研究方向为烟草化学和生物标志物，Email：huqy@ztri.com.cn王安，研究员，研究方向为环境监测光纤传感技术，Email：wangan@aiofm.ac.cn

2012-07-03