紫花地丁含药血清对巨噬细胞吞噬功能及TOLL样受体表达的影响①

张智伟 蔡 琨 吴玛莉 于红红 冷 泠 岳文鹏 田维毅

(贵阳中医学院基础医学院，贵阳 550002)

紫花地丁载于《本草纲目》，具有清热解毒、凉血消肿、消痈散结的功效。临床报道，紫花地丁常用于治疗腮腺炎、蜂窝组织炎、疖肿、静脉炎、自身免疫性不孕、过敏性紫癜性肾炎等炎症性和免疫性疾病［1-6］。巨噬细胞是机体炎症和免疫反应的重要调控因素，其功能状况与机体炎症/免疫过程密切相关。巨噬细胞表面Toll样受体(Toll-like receptors，TLRs)是近年来发现的一类重要模式识别受体，在巨噬细胞上有大量分布，是其活化和释放炎症细胞因子的重要信号通路［7］。巨噬细胞Toll样受体在哺乳动物已发现13个成员，其中以TLR-1～5的研究尤为多见。在我们前期研究中发现，紫花地丁含药血清在一定浓度下对巨噬细胞分泌NO、TNF-α和IL-6具有显著调节作用。有文献报道，在炎症反应初期，适量的NO、TNF-α分泌是机体对抗炎症的积极反应，但是如果它们持续不断地释放则会导致炎症的不断扩大、加重［8］。为了进一步探索紫花地丁干预巨噬细胞分泌炎症因子的机制，本文采用血清药理方法，考察了紫花地丁含药血清对巨噬细胞吞噬功能和Toll样受体1～5mRNA表达的影响。

1 材料与方法

1.1 主要仪器 NU-440-400E型生物安全柜(美国Nuair)，MK3型酶标仪(美国 Thermo)，F-32水浴锅(德国 Julabo)，Biometra TProfessional Thermocycler PCR仪(德国Biometra)，CO2培养箱(美国Thermo)，BIO-RAD GelDoc 2000凝胶成像系统(美国伯乐)。

1.2 主要试剂 DMEM培养基(美国Gibco)，Trizol reagent(美国 Invitrogen)，逆转录试剂盒与 Taq酶(大连宝生物)，PCR反应引物(北京鼎国昌盛生物科技有限公司合成)，中性红(上海试剂三厂)。

1.3 实验药物 中药紫花地丁购自北京同仁堂药店贵阳店，经贵阳中医学院生药实验室鉴定为正品。采用常规方法制备水煎剂，按8 ml(水)∶1 g(生药)比例，加超纯水浸泡30 min，煮沸30 min，趁热4层纱布过滤，滤液自然滴尽，第2煎按6 ml(水)∶1 g(生药)比例加水，如前法煮沸30 min并过滤，合并两次滤液，加热浓缩成相当于生药3 g/ml的水煎液，4℃保存，1周内使用。

1.4 实验动物 制备含药血清选用清洁级SD大鼠，雄性，体重180～200 g;制备腹腔巨噬细胞选用清洁级KM小鼠，雌雄不分，体重18～22 g。实验动物均购自贵阳医学院实验动物中心［动物合格证SCXK(黔)2002-0001］。

1.5 紫花地丁含药血清的制备 将实验大鼠随机分为正常血清对照组和紫花地丁含药血清组，每组10只，紫花地丁含药血清组每天以15 g/kg(大鼠体重)分2次(12 h 1次)灌胃，给药体积为1 ml/100 g，对照组代以等体积生理盐水，连续3 d。最后一次给药前12 h禁食不禁水，每组于最后一次给药后0.5 h开始随机抽取1只大鼠股动脉采血，每10 min采集1只，到2 h采完。所有血液常温静置4 h后3 000 r/min离心10 min，收集上清并混合，56℃30 min灭活补体，22 μm 过滤除菌，－80℃保存备用。根据前期观察含药血清的细胞毒性实验结果，选用对巨噬细胞安全的5%～20%含药血清为本实验的血清浓度。

1.6 小鼠腹腔巨噬细胞的制备 小鼠腹腔注射3%硫代乙醇酸钠1 ml，3 d后，常规无菌操作向腹腔内注入10 ml磷酸盐缓冲液(PBS)，轻揉腹部3～5 min，用吸管收集腹腔液，1 000 r/min离心5 min，PBS液洗涤细胞3次，弃上清，加入含15%灭活胎牛血清的DMEM培养液，调整细胞浓度至5×106个/ml。在96孔板中，每孔加入细胞悬液100 μl，37℃、5%CO2温育贴壁2 h后立即用于下列实验。

1.7 中性红法检测巨噬细胞吞噬活性 在上述96孔板中，将贴壁2 h后的细胞悬液弃上清，然后加入用含血清的DMEM培养液配制的浓度为0.002 g/ml的中性红溶液200 μl/孔，置37℃、5%CO2培养3 h，弃中性红溶液，PBS冲洗3次，每孔加入细胞裂解液(体积分数50%的乙酸和体积分数50%的无水乙醇的混合液)200 μl，室温下放置24 h，待细胞溶解后，492 nm测定吸光度。

1.8 RT-PCR法检测巨噬细胞TLR-1、TLR-2、TLR-3、TLR-4、TLR-5 mRNA表达 取上述培养24 h的细胞，按说明书用Trizol法提取总RNA为模板，以Oligo-dT为引物逆转录合成 cDNA。PCR引物按NCBI中Primer-BLAST设计，序列如表1。反应条件:94℃，45 s;53℃，45 s;72℃，1 min;35 cycles。反应体系:ddH2O 17.5 μl，10×PCR buffer 2.5 μl，10×dNTP Mix 2.5 μl，Primer1 0.5 μl，Primer2 0.5 μl，Taq plusDNA 0.5 μl，cDNA 1 μl。先将 GAPDH 电泳结果由Quantity One软件采用等高线定量法分析，确定添加模板量，进而调整添加模板与灭菌水的比例并进行PCR，Quantity One软件分析电泳结果。同时将所得PCR产物进行胶回收，送上海生工生物工程股份有限公司单向测序，并在 NCBI中进行BLAST分析其吻合度，结果见表1。

1.9 统计学分析 实验结果采用SPSS17.0统计软件分析。检测数据以表示，P＜0.05 为差异具有显著性。

2 结果

2.1 紫花地丁含药血清对小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能的影响 图1结果显示，与相同浓度正常血清对照组比较:紫花地丁含药血清各浓度组巨噬细胞中性红吞噬量明显升高(P＜0.01)。

2.2 紫花地丁含药血清对小鼠腹腔巨噬细胞TLR-1、TLR-2、TLR-3、TLR-4、TLR-5 mRNA 表达的影响图2和表2结果显示，与相同浓度正常血清对照组比较:(1)TLR-1mRNA表达量:5%浓度组显著升高(P＜0.01)，而10%和20%浓度组显著降低(P＜0.05或 P＜0.01);(2)TLR-2mRNA表达量:10%浓度组量显著降低(P＜0.01)，而20%浓度组显著升高(P＜0.01);(3)TLR-3mRNA表达量:5%浓度组升高(P＜0.05)，而 10%浓度组显著降低(P＜0.01);(4)TLR-4mRNA表达量:各浓度组无显著变化(P＞0.05);(5)TLR-5mRNA表达量:各浓度组显著升高(P＜0.01)。

表1 RT-PCR的引物及产物的吻合度Tab.1 Primers for RT-PCR and identities of product

表2 紫花地丁含药血清对小鼠腹腔巨噬细胞TLR-1～5 mRNA表达量的影响(，n=8)Tab.2 Effects of viola-containing serum on expression level of TLR-1－5 mRNA in mouse macrophages(，n=8)

表2 紫花地丁含药血清对小鼠腹腔巨噬细胞TLR-1～5 mRNA表达量的影响(，n=8)Tab.2 Effects of viola-containing serum on expression level of TLR-1－5 mRNA in mouse macrophages(，n=8)

Note:1)P＜0.05，compared with the same concentration of normal serum group;2)P＜0.01，compared with the same concentration of normal serum group.

.51 10.49±1.32 3.51±2.90 10 15.55±2.00 11.20±1.00 10.33±2.18 11.56±4.56 4.23 ±2.36 20 5.10±0.51 7.32±0.16 3.74±2.37 6.75±1.58 2.52±1.80 Viola-containing serum 5 15.12±1.602) 11.14±1.02 17.67±3.111) 10.02±1.71 11.69±3.132)10 9.54±1.412) 8.81±1.102) 3.77±1.342) 8.99±2.34 14.43±1.952)20 3.30±1.351) 8.87±0.992) 3.08±1.98 5.94±1.40 14.57±2.932)-4 TLR-5 Normal serum 5 10.53±2.73 10.45±1.89 13.09±1 Groups Serum concentration(%)%Adj.Vol.(Relative gray values)TLR-1 TLR-2 TLR-3 TLR

图1 紫花地丁含药血清对小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能的影响(n=8)Fig.1 Effectsofviolacontaining serum on mouse macrophages phagocytosis activity(n=8)

3 讨论

图2 小鼠腹腔巨噬细胞 TLR-1、TLR-2、TLR-3、TLR-4、TLR-5 mRNA表达Fig.2 Expression of TLR-1，TLR-2，TLR-3，TLR-4 and TLR-5 mRNA in mouse macrophages

血清药理学方法由日本学者田代真一在上世纪80年代提出［9］。这种方法具有实验周期短、条件易于控制、结果易于观察等特点。因其“半体内”特点更贴近中药在体内发挥药理作用，被广泛应用于中药作用机制的研究。巨噬细胞是机体免疫系统的重要细胞成员，具有识别和吞噬异物、提呈抗原、分泌多种活性介质等作用，参与维持机体的免疫稳态［10］。静息状态的巨噬细胞功能低下，只有在活化状后才能发挥较强的吞噬、分泌、炎症和免疫调控等功能［10］。为了探索紫花地丁对巨噬细胞活化作用及其机制，我们考察了紫花地丁含药血清对巨噬细胞吞噬功能和Toll样受体1～5mRNA表达的影响。

本实验结果显示:(1)紫花地丁含药血清各浓度组较正常血清组巨噬细胞中性红吞噬量明显升高(P＜0.01);(2)紫花地丁含药血清一定浓度组TLR-1、TLR-2和TLR-3的mRNA表达量表现出升高或降低(P＜0.05或 P＜0.01)，TLR-4mRNA 表达量无显著变化(P＞0.05)，TLR-5mRNA表达量显著升高(P＜0.01)。实验结果提示:紫花地丁含药血清对巨噬细胞吞噬功能具有明显促进作用;对不同TOLL样受体mRNA表达量的干预作用则表现各异。Farhat等［12］报道 TLR-1与 TLR-2可协同发挥识别作用;王梁华等［13］报道TLR-2的多抗能部分抑制LPS激活巨噬细胞吞噬金葡萄球菌的能力，也能部分阻断对U937细胞的吞噬活性;Wang等［14］报道，在西尼罗病毒感染的小胶质细胞中TLR-3缺乏导致IL-6和TNF-α分泌减少;张代娟等［15］报道青心酮预处理能显著上调可溶性Toll样受体4(sTLR4)mRNA及蛋白表达，减少TNF-α分泌，抑制炎症反应;赵保胜等报道，黄连解毒汤能阻断TLR-4高表达，阻断TLR-4胞内信号转导的MyD88依赖和非依赖两条途径(以阻断非依赖途径为主)，抑制相关基因表达产物TNF-α、IFN-β过度分泌，具有 TLR4拮抗剂样作用［16］;李岩等［17］报道黄芩苷可以抑制脂多糖介导的TLR-4表达增高，同时减弱脂多糖诱导的TLR4信号途径激活，抑制I-κB降解，降低TNF-α表达;Hayashi等［18］报道TLR-5可调动核因子 NF-κB并刺激TNF-α分泌。我们前期研究显示，一定浓度的紫花地丁含药血清能促进巨噬细胞分泌TNF-α、NO(P＜0.05 或 P＜0.01);而对 IL-6 分泌具有双向调节作用(P＜0.01)。结合本实验结果，推测紫花地丁含药血清调控巨噬细胞TOLL样受体的表达可能是该药干预巨噬细胞吞噬功能和分泌炎症因子的途径之一;同时紫花地丁作为临床抗感染和抗炎治疗的常用中药，其基于巨噬细胞的免疫和炎症干预作用可能是该药临床疗效的中药机制。

在本实验结果中，不同浓度的正常血清组巨噬细胞TLR-1～5的表达量存在差异，这可能是因血清中原有的TOLL样受体调控物质表现出的量效差异性;同时，本实验不同浓度的含药血清对巨噬细胞TLR-1～3的表达量呈现双向调节作用，这反映了中药成分及其药理效应的复杂性和多样性，其具体机制有待进一步探索。

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