蝴蝶兰花梗离体培养中褐变的控制研究

黄靖

摘 要：该文以蝴蝶兰花后带腋芽花梗节为外植体，比较了附加不同激素的MS培养基以及不同培养条件对控制外植体褐变的影响。结果表明，采用1/2MS+BA3.0mg/L+NAA2.0mg/L+10%椰子汁的配方对控制花梗褐变及诱导丛生芽效果最为显著。

关键词：蝴蝶兰；花梗；离体培养；褐变；控制

中图分类号 S68 文献标识码 A 文章编号 1007-7731（2014）21-23-02

蝴蝶兰（Phalaenopsis）属兰科植物，因其风姿绰约、体态轻盈、花色秀丽、气质飘逸，被誉为“洋兰王后”，其原生种的花色因种类不同而有较大的变化。由于蝴蝶兰的种子在自然条件下发芽率极低，很难利用种子播种的方式来进行有性繁殖，而且由于蝴蝶兰属单茎气生兰，在植株上少有侧枝，也难以采用常规分株法进行无性繁殖。因此，采用离体快速繁殖技术，对于扩大蝴蝶兰的繁殖是非常必要的，利用花梗离体培养是当前蝴蝶兰快速繁殖的主要途径。但蝴蝶兰在组培快繁生产中存在着极易褐变夭折的问题，褐化直接影响蝴蝶兰离体培养的正常进行，包括芽的萌发和增殖效果，生长缓慢，严重时会导致培养材料死亡。为此，笔者针对蝴蝶兰花梗腋芽离体快繁褐变问题进行了相关试验研究，以期为蝴蝶兰工厂化生产提供参考。

1 材料与方法

1.1 供试材料 蝴蝶兰选用V31品种，福建新世景园艺有限公司生产。试验用药品均为分析纯。

1.2 试验方法 选取健壮无病虫害的蝴蝶兰花梗，剥除花朵和花蕾后将花柄清净，用解剖刀切成2～4cm段，每段带一个腋芽。流水冲洗0.5h后用75%酒精浸泡30s，然后用无菌水冲洗干净，在超净工作台上用0.1%HgCl2溶液浸泡16min，取出后用无菌水冲洗5～8次，无菌滤纸吸干用解剖刀切除外植体顶部与基部各0.5～1cm部分，形成1～2cm长茎段，每瓶接种一个外植体。然后以MS、1/2MS、1/4MS为基本培养基，激素采用NAA与BA，另添加椰子汁、抗坏血酸、活性炭等物质，进行蝴蝶兰离体培养。在光照培养室温度为25℃，光照强度2 000lx，光照时间12h/d的条件下诱导。

2 结果与分析

2.1 不同培养基对花梗褐变的影响 将基本培养基分别设置为MS、1/2MS、1/4MS，各培养基均加BA3.0mg/L，接种后每10d进行观察，一个月后统计结果见表1。外植体接种10d后，各处理的茎段开始萌动，以后陆续萌芽，长出芽苗。MS培养基处理首先出现褐变，20d后1/2MS培养基处理也开始出现褐化现象；一个月后进行统计观察，1/2MS培养基处理的外植体萌芽率最高，1/4MS培养基处理的外植体褐变程度最轻；60d后观察，1/4MS培养基处理的腋芽生长状态较差。因此，生产上应选择1/2MS培养基或适时更换培养基，以防止无机营养缺乏。

2.2 不同激素配比对花梗褐变的影响 以蝴蝶兰带腋芽花梗节为外植体，以l/2MS为基本培养基，添加不同浓度的6-BA和NAA，每瓶接种1个外植体，接种培养10d后开始观察，培养一个月后统计结果见表2。由表2可知，培养基中不含外源激素时，培养30d后也有少量花梗腋芽萌发，但培养基褐化现象较重（43.3%）；在培养基中添加BA 3.0mg/L时，蝴蝶兰花梗腋芽萌芽数最高（83个），继续添加BA 5.0mg/L萌芽数有所降低（57个），褐变现象最为严重（73.3%）；在BA 3.0mg/L的基础上添加NAA，BA 3.0mg/L+NAA 2.0mg/L的激素配比，萌芽数及褐变率都在最优范围内，分别为79个和26.7%。

2.3 不同添加物对花梗褐变的影响 椰子汁是一种天然的复合有机物，含有丰富的氨基酸、矿物质、维生素和碳水化合物等，这些物质具有促进培养物的生长，提高存活率，减少褐化死亡现象的作用。抗坏血酸是植物组织培养中常用的抗褐变剂，其对外植体褐变的抑制多有报道。活性炭具有较强的吸附能力，对抑制褐变起重要作用。本试验以1/2MS+BA3.0mg/L+NAA2.0mg/L为基础培养基，分别添加5%椰子汁、10%椰子汁、50mg/LVC、100mg/LVC、500mg/L活性炭、2 000mg/L活性炭等，与未添加上达物质的培养一个月后统计结果见表3。从表3可知，附加活性炭的培养基能明显抑制外植体褐变产生，但是由于活性炭不但对培养基中的醌类化合物有吸附作用，同时也吸附了部分分裂素、生长素、维生素等相关成分，在抑制褐化的同时也严重影响到芽的萌发和增殖效果；而添加10%的椰子汁或100mg/L抗坏血酸的培养基，均能有效抑制褐变，从萌芽效果看，添加椰子汁的培养基效果较添加抗坏血酸的优。

2.4 不同培养条件对花梗褐变及生长的影响 将接种于1/2MS+BA 3.0mg/L+NAA 2.0mg/L培养基上的蝴蝶兰花梗节放置于不同温度及不同光照的培养环境内，比较其褐变及生长情况，结果见表4。由表4可知，蝴蝶兰花梗节培养过程中温度应比较恒定，若温度过低，形成原球茎丛生芽所需时间较长，生长缓慢，若温度过高，则容易造成污染褐变率也上升；同样，暗培养对控制褐变有显著效果，但由于缺乏光照，材料生长缓慢，在暗培养一定时间后应移至常规光照条件下放置。

3 结论与讨论

国内外蝴蝶兰离体快繁以茎尖为外植体的研究较多，尽管茎尖容易脱分化并再分化成完整植株，但由于蝴蝶兰为单茎性植物，摘取茎尖就会牺牲母株，造成不必要的浪费。因此，在实际的生产中，现阶段代替蝴蝶兰茎尖培养的方法是利用蝴蝶兰的花梗作为外植体进行培养，其花梗通常只有4～5个腋芽，腋芽启动培养的效果直接关系到增殖培养时无菌材料的多少，从而影响花梗快速繁殖的效率。以蝴蝶兰花梗为材料建立蝴蝶兰的无性繁殖体系，比采用根尖、茎尖和种子进行蝴蝶兰的快速无性繁殖更具有应用价值。兰科植物在外植体诱导和原球茎分化培养时都存在褐变死亡的问题，因而减轻或控制褐变发生是兰科植物组织培养研究的重要内容。

本研究针对蝴蝶兰组培褐变问题进行了试验研究，尝试探寻蝴蝶兰花梗腋芽培养过程中有效控制褐变的方法。试验表明：适当降低无机离子浓度，有利于降低外植体褐变率；恰当的细胞分裂素BA与生长素NAA配比，在控制褐变及诱导丛生芽上有增效作用；添加一定剂量的椰子汁、抗坏血酸、活性炭等均可减轻褐变，但活性炭对外源激素的吸附较大；在培养环境上，短期暗培养有利于减轻外植体的褐变，低温虽然也能降低褐变率，但由于此条件下试验材料生长缓慢，对于工厂化育苗意义不大。

参考文献

[1]曾都华，郁培义，陈伟玉，等.“满天红”蝴蝶兰花梗组培快繁技术研究[J].热带林业，2014，42（1）：46-49.

[2]王玲，陈发棣，陈凤，等.不同培养基及添加物对蝴蝶兰花梗芽壮苗生根的影响[J].江苏农业科学，2013，41（5）：134-136.

[3]印芳，彭克勤，葛红，等.矿质元素对蝴蝶兰组培褐变的影响[J].北方园艺，2006（6）：137-139.

[4]张凡凡.蝴蝶兰组培快繁中褐变问题的研究进展[J].探索，2010（5）：362. （责编：张宏民）endprint

摘 要：该文以蝴蝶兰花后带腋芽花梗节为外植体，比较了附加不同激素的MS培养基以及不同培养条件对控制外植体褐变的影响。结果表明，采用1/2MS+BA3.0mg/L+NAA2.0mg/L+10%椰子汁的配方对控制花梗褐变及诱导丛生芽效果最为显著。

关键词：蝴蝶兰；花梗；离体培养；褐变；控制

中图分类号 S68 文献标识码 A 文章编号 1007-7731（2014）21-23-02

蝴蝶兰（Phalaenopsis）属兰科植物，因其风姿绰约、体态轻盈、花色秀丽、气质飘逸，被誉为“洋兰王后”，其原生种的花色因种类不同而有较大的变化。由于蝴蝶兰的种子在自然条件下发芽率极低，很难利用种子播种的方式来进行有性繁殖，而且由于蝴蝶兰属单茎气生兰，在植株上少有侧枝，也难以采用常规分株法进行无性繁殖。因此，采用离体快速繁殖技术，对于扩大蝴蝶兰的繁殖是非常必要的，利用花梗离体培养是当前蝴蝶兰快速繁殖的主要途径。但蝴蝶兰在组培快繁生产中存在着极易褐变夭折的问题，褐化直接影响蝴蝶兰离体培养的正常进行，包括芽的萌发和增殖效果，生长缓慢，严重时会导致培养材料死亡。为此，笔者针对蝴蝶兰花梗腋芽离体快繁褐变问题进行了相关试验研究，以期为蝴蝶兰工厂化生产提供参考。

1 材料与方法

1.1 供试材料 蝴蝶兰选用V31品种，福建新世景园艺有限公司生产。试验用药品均为分析纯。

1.2 试验方法 选取健壮无病虫害的蝴蝶兰花梗，剥除花朵和花蕾后将花柄清净，用解剖刀切成2～4cm段，每段带一个腋芽。流水冲洗0.5h后用75%酒精浸泡30s，然后用无菌水冲洗干净，在超净工作台上用0.1%HgCl2溶液浸泡16min，取出后用无菌水冲洗5～8次，无菌滤纸吸干用解剖刀切除外植体顶部与基部各0.5～1cm部分，形成1～2cm长茎段，每瓶接种一个外植体。然后以MS、1/2MS、1/4MS为基本培养基，激素采用NAA与BA，另添加椰子汁、抗坏血酸、活性炭等物质，进行蝴蝶兰离体培养。在光照培养室温度为25℃，光照强度2 000lx，光照时间12h/d的条件下诱导。

2 结果与分析

2.1 不同培养基对花梗褐变的影响 将基本培养基分别设置为MS、1/2MS、1/4MS，各培养基均加BA3.0mg/L，接种后每10d进行观察，一个月后统计结果见表1。外植体接种10d后，各处理的茎段开始萌动，以后陆续萌芽，长出芽苗。MS培养基处理首先出现褐变，20d后1/2MS培养基处理也开始出现褐化现象；一个月后进行统计观察，1/2MS培养基处理的外植体萌芽率最高，1/4MS培养基处理的外植体褐变程度最轻；60d后观察，1/4MS培养基处理的腋芽生长状态较差。因此，生产上应选择1/2MS培养基或适时更换培养基，以防止无机营养缺乏。

2.2 不同激素配比对花梗褐变的影响 以蝴蝶兰带腋芽花梗节为外植体，以l/2MS为基本培养基，添加不同浓度的6-BA和NAA，每瓶接种1个外植体，接种培养10d后开始观察，培养一个月后统计结果见表2。由表2可知，培养基中不含外源激素时，培养30d后也有少量花梗腋芽萌发，但培养基褐化现象较重（43.3%）；在培养基中添加BA 3.0mg/L时，蝴蝶兰花梗腋芽萌芽数最高（83个），继续添加BA 5.0mg/L萌芽数有所降低（57个），褐变现象最为严重（73.3%）；在BA 3.0mg/L的基础上添加NAA，BA 3.0mg/L+NAA 2.0mg/L的激素配比，萌芽数及褐变率都在最优范围内，分别为79个和26.7%。

2.3 不同添加物对花梗褐变的影响 椰子汁是一种天然的复合有机物，含有丰富的氨基酸、矿物质、维生素和碳水化合物等，这些物质具有促进培养物的生长，提高存活率，减少褐化死亡现象的作用。抗坏血酸是植物组织培养中常用的抗褐变剂，其对外植体褐变的抑制多有报道。活性炭具有较强的吸附能力，对抑制褐变起重要作用。本试验以1/2MS+BA3.0mg/L+NAA2.0mg/L为基础培养基，分别添加5%椰子汁、10%椰子汁、50mg/LVC、100mg/LVC、500mg/L活性炭、2 000mg/L活性炭等，与未添加上达物质的培养一个月后统计结果见表3。从表3可知，附加活性炭的培养基能明显抑制外植体褐变产生，但是由于活性炭不但对培养基中的醌类化合物有吸附作用，同时也吸附了部分分裂素、生长素、维生素等相关成分，在抑制褐化的同时也严重影响到芽的萌发和增殖效果；而添加10%的椰子汁或100mg/L抗坏血酸的培养基，均能有效抑制褐变，从萌芽效果看，添加椰子汁的培养基效果较添加抗坏血酸的优。

2.4 不同培养条件对花梗褐变及生长的影响 将接种于1/2MS+BA 3.0mg/L+NAA 2.0mg/L培养基上的蝴蝶兰花梗节放置于不同温度及不同光照的培养环境内，比较其褐变及生长情况，结果见表4。由表4可知，蝴蝶兰花梗节培养过程中温度应比较恒定，若温度过低，形成原球茎丛生芽所需时间较长，生长缓慢，若温度过高，则容易造成污染褐变率也上升；同样，暗培养对控制褐变有显著效果，但由于缺乏光照，材料生长缓慢，在暗培养一定时间后应移至常规光照条件下放置。

3 结论与讨论

国内外蝴蝶兰离体快繁以茎尖为外植体的研究较多，尽管茎尖容易脱分化并再分化成完整植株，但由于蝴蝶兰为单茎性植物，摘取茎尖就会牺牲母株，造成不必要的浪费。因此，在实际的生产中，现阶段代替蝴蝶兰茎尖培养的方法是利用蝴蝶兰的花梗作为外植体进行培养，其花梗通常只有4～5个腋芽，腋芽启动培养的效果直接关系到增殖培养时无菌材料的多少，从而影响花梗快速繁殖的效率。以蝴蝶兰花梗为材料建立蝴蝶兰的无性繁殖体系，比采用根尖、茎尖和种子进行蝴蝶兰的快速无性繁殖更具有应用价值。兰科植物在外植体诱导和原球茎分化培养时都存在褐变死亡的问题，因而减轻或控制褐变发生是兰科植物组织培养研究的重要内容。

本研究针对蝴蝶兰组培褐变问题进行了试验研究，尝试探寻蝴蝶兰花梗腋芽培养过程中有效控制褐变的方法。试验表明：适当降低无机离子浓度，有利于降低外植体褐变率；恰当的细胞分裂素BA与生长素NAA配比，在控制褐变及诱导丛生芽上有增效作用；添加一定剂量的椰子汁、抗坏血酸、活性炭等均可减轻褐变，但活性炭对外源激素的吸附较大；在培养环境上，短期暗培养有利于减轻外植体的褐变，低温虽然也能降低褐变率，但由于此条件下试验材料生长缓慢，对于工厂化育苗意义不大。

参考文献

[1]曾都华，郁培义，陈伟玉，等.“满天红”蝴蝶兰花梗组培快繁技术研究[J].热带林业，2014，42（1）：46-49.

[2]王玲，陈发棣，陈凤，等.不同培养基及添加物对蝴蝶兰花梗芽壮苗生根的影响[J].江苏农业科学，2013，41（5）：134-136.

[3]印芳，彭克勤，葛红，等.矿质元素对蝴蝶兰组培褐变的影响[J].北方园艺，2006（6）：137-139.

[4]张凡凡.蝴蝶兰组培快繁中褐变问题的研究进展[J].探索，2010（5）：362. （责编：张宏民）endprint

摘 要：该文以蝴蝶兰花后带腋芽花梗节为外植体，比较了附加不同激素的MS培养基以及不同培养条件对控制外植体褐变的影响。结果表明，采用1/2MS+BA3.0mg/L+NAA2.0mg/L+10%椰子汁的配方对控制花梗褐变及诱导丛生芽效果最为显著。

关键词：蝴蝶兰；花梗；离体培养；褐变；控制

中图分类号 S68 文献标识码 A 文章编号 1007-7731（2014）21-23-02

蝴蝶兰（Phalaenopsis）属兰科植物，因其风姿绰约、体态轻盈、花色秀丽、气质飘逸，被誉为“洋兰王后”，其原生种的花色因种类不同而有较大的变化。由于蝴蝶兰的种子在自然条件下发芽率极低，很难利用种子播种的方式来进行有性繁殖，而且由于蝴蝶兰属单茎气生兰，在植株上少有侧枝，也难以采用常规分株法进行无性繁殖。因此，采用离体快速繁殖技术，对于扩大蝴蝶兰的繁殖是非常必要的，利用花梗离体培养是当前蝴蝶兰快速繁殖的主要途径。但蝴蝶兰在组培快繁生产中存在着极易褐变夭折的问题，褐化直接影响蝴蝶兰离体培养的正常进行，包括芽的萌发和增殖效果，生长缓慢，严重时会导致培养材料死亡。为此，笔者针对蝴蝶兰花梗腋芽离体快繁褐变问题进行了相关试验研究，以期为蝴蝶兰工厂化生产提供参考。

1 材料与方法

1.1 供试材料 蝴蝶兰选用V31品种，福建新世景园艺有限公司生产。试验用药品均为分析纯。

1.2 试验方法 选取健壮无病虫害的蝴蝶兰花梗，剥除花朵和花蕾后将花柄清净，用解剖刀切成2～4cm段，每段带一个腋芽。流水冲洗0.5h后用75%酒精浸泡30s，然后用无菌水冲洗干净，在超净工作台上用0.1%HgCl2溶液浸泡16min，取出后用无菌水冲洗5～8次，无菌滤纸吸干用解剖刀切除外植体顶部与基部各0.5～1cm部分，形成1～2cm长茎段，每瓶接种一个外植体。然后以MS、1/2MS、1/4MS为基本培养基，激素采用NAA与BA，另添加椰子汁、抗坏血酸、活性炭等物质，进行蝴蝶兰离体培养。在光照培养室温度为25℃，光照强度2 000lx，光照时间12h/d的条件下诱导。

2 结果与分析

2.1 不同培养基对花梗褐变的影响 将基本培养基分别设置为MS、1/2MS、1/4MS，各培养基均加BA3.0mg/L，接种后每10d进行观察，一个月后统计结果见表1。外植体接种10d后，各处理的茎段开始萌动，以后陆续萌芽，长出芽苗。MS培养基处理首先出现褐变，20d后1/2MS培养基处理也开始出现褐化现象；一个月后进行统计观察，1/2MS培养基处理的外植体萌芽率最高，1/4MS培养基处理的外植体褐变程度最轻；60d后观察，1/4MS培养基处理的腋芽生长状态较差。因此，生产上应选择1/2MS培养基或适时更换培养基，以防止无机营养缺乏。

2.2 不同激素配比对花梗褐变的影响 以蝴蝶兰带腋芽花梗节为外植体，以l/2MS为基本培养基，添加不同浓度的6-BA和NAA，每瓶接种1个外植体，接种培养10d后开始观察，培养一个月后统计结果见表2。由表2可知，培养基中不含外源激素时，培养30d后也有少量花梗腋芽萌发，但培养基褐化现象较重（43.3%）；在培养基中添加BA 3.0mg/L时，蝴蝶兰花梗腋芽萌芽数最高（83个），继续添加BA 5.0mg/L萌芽数有所降低（57个），褐变现象最为严重（73.3%）；在BA 3.0mg/L的基础上添加NAA，BA 3.0mg/L+NAA 2.0mg/L的激素配比，萌芽数及褐变率都在最优范围内，分别为79个和26.7%。

2.3 不同添加物对花梗褐变的影响 椰子汁是一种天然的复合有机物，含有丰富的氨基酸、矿物质、维生素和碳水化合物等，这些物质具有促进培养物的生长，提高存活率，减少褐化死亡现象的作用。抗坏血酸是植物组织培养中常用的抗褐变剂，其对外植体褐变的抑制多有报道。活性炭具有较强的吸附能力，对抑制褐变起重要作用。本试验以1/2MS+BA3.0mg/L+NAA2.0mg/L为基础培养基，分别添加5%椰子汁、10%椰子汁、50mg/LVC、100mg/LVC、500mg/L活性炭、2 000mg/L活性炭等，与未添加上达物质的培养一个月后统计结果见表3。从表3可知，附加活性炭的培养基能明显抑制外植体褐变产生，但是由于活性炭不但对培养基中的醌类化合物有吸附作用，同时也吸附了部分分裂素、生长素、维生素等相关成分，在抑制褐化的同时也严重影响到芽的萌发和增殖效果；而添加10%的椰子汁或100mg/L抗坏血酸的培养基，均能有效抑制褐变，从萌芽效果看，添加椰子汁的培养基效果较添加抗坏血酸的优。

2.4 不同培养条件对花梗褐变及生长的影响 将接种于1/2MS+BA 3.0mg/L+NAA 2.0mg/L培养基上的蝴蝶兰花梗节放置于不同温度及不同光照的培养环境内，比较其褐变及生长情况，结果见表4。由表4可知，蝴蝶兰花梗节培养过程中温度应比较恒定，若温度过低，形成原球茎丛生芽所需时间较长，生长缓慢，若温度过高，则容易造成污染褐变率也上升；同样，暗培养对控制褐变有显著效果，但由于缺乏光照，材料生长缓慢，在暗培养一定时间后应移至常规光照条件下放置。

3 结论与讨论

国内外蝴蝶兰离体快繁以茎尖为外植体的研究较多，尽管茎尖容易脱分化并再分化成完整植株，但由于蝴蝶兰为单茎性植物，摘取茎尖就会牺牲母株，造成不必要的浪费。因此，在实际的生产中，现阶段代替蝴蝶兰茎尖培养的方法是利用蝴蝶兰的花梗作为外植体进行培养，其花梗通常只有4～5个腋芽，腋芽启动培养的效果直接关系到增殖培养时无菌材料的多少，从而影响花梗快速繁殖的效率。以蝴蝶兰花梗为材料建立蝴蝶兰的无性繁殖体系，比采用根尖、茎尖和种子进行蝴蝶兰的快速无性繁殖更具有应用价值。兰科植物在外植体诱导和原球茎分化培养时都存在褐变死亡的问题，因而减轻或控制褐变发生是兰科植物组织培养研究的重要内容。

本研究针对蝴蝶兰组培褐变问题进行了试验研究，尝试探寻蝴蝶兰花梗腋芽培养过程中有效控制褐变的方法。试验表明：适当降低无机离子浓度，有利于降低外植体褐变率；恰当的细胞分裂素BA与生长素NAA配比，在控制褐变及诱导丛生芽上有增效作用；添加一定剂量的椰子汁、抗坏血酸、活性炭等均可减轻褐变，但活性炭对外源激素的吸附较大；在培养环境上，短期暗培养有利于减轻外植体的褐变，低温虽然也能降低褐变率，但由于此条件下试验材料生长缓慢，对于工厂化育苗意义不大。

参考文献

[1]曾都华，郁培义，陈伟玉，等.“满天红”蝴蝶兰花梗组培快繁技术研究[J].热带林业，2014，42（1）：46-49.

[2]王玲，陈发棣，陈凤，等.不同培养基及添加物对蝴蝶兰花梗芽壮苗生根的影响[J].江苏农业科学，2013，41（5）：134-136.

[3]印芳，彭克勤，葛红，等.矿质元素对蝴蝶兰组培褐变的影响[J].北方园艺，2006（6）：137-139.

[4]张凡凡.蝴蝶兰组培快繁中褐变问题的研究进展[J].探索，2010（5）：362. （责编：张宏民）endprint