NaOH/尿素低温溶解法测定烟梗木质素含量的研究

孔浩辉,李秀丽,黄翼飞,纪楷滨,3,楼宏铭,4,邱学青,4,杨东杰

1广东中烟工业有限责任公司技术中心,广州,广东,5101385；

2华南理工大学化学与化工学院,广州,广东,510641；

3广州市质量监督检测研究院,广州,广东,510110；

4制浆造纸工程国家重点实验室,广州,广东,510641

NaOH/尿素低温溶解法测定烟梗木质素含量的研究

孔浩辉1,李秀丽2,黄翼飞1,纪楷滨2,3,楼宏铭2,4,邱学青2,4,杨东杰2

1广东中烟工业有限责任公司技术中心,广州,广东,5101385；

2华南理工大学化学与化工学院,广州,广东,510641；

3广州市质量监督检测研究院,广州,广东,510110；

4制浆造纸工程国家重点实验室,广州,广东,510641

建立了一种准确测定烟梗木质素含量的新方法。用低温NaOH/尿素水溶液抽提烟梗,除去糖类等杂质,然后在优化条件（硫酸浓度17.5 %、液固比80 mL·g-1、酸解温度100 ℃、酸解时间30 min）下采用酸处理打断烟梗中木质素与纤维素等组份之间的化学键,并得到酸溶木质素,残渣进一步用低温NaOH/尿素水溶液处理,溶解纤维素、半纤维素等天然高分子物质,得到酸不溶木质素。酸溶木质素采用分光光度法在325 nm处测定,酸不溶木质素采用灼烧法测定。本方法RSD小于3%,准确度良好,且减少了有机溶剂预处理和浓硫酸处理,提高了测试的安全性。

烟梗；木质素；氢氧化钠/尿素水溶液；低温溶解；酸处理

木质素是仅次于纤维素的一种最丰富的高分子,广泛存在于各种植物的细胞壁结构中[1-2]。木质素是由三种苯丙烷基单体经酶脱氢聚合形成的酚型三维网状高分子,填充在细胞壁的微纤丝之间,能够减少纤维素和半纤维素等组份遭受微生物及其分泌的酶的侵害[1-2]。从分子结构可以看出,木质素是烟叶中主要的芳香族组分,因而也可能是焦油中稠环芳烃类、芳香胺等有害物质的主要来源。木质素热解的产物中含有儿茶酚和烷基儿茶酚,可引起涩口且有促癌活性[3-4]。深入研究烟叶中木质素的含量、分布及其结构,掌握烟叶木质素在燃吸条件下的反应机理并建立减少有害物质生成的调控途径,对于烟草行业的“降焦、减害、保香”具有深远意义。

目前,测定木本类植物、纸浆原料和产品中木质素含量的方法主要是硫酸法[5-10]。而烟叶的化学组成复杂,包括纤维素、半纤维素、淀粉等糖类、木质素、氨基酸/蛋白质、脂质类、醇类、酯类、杂环类、生物碱、酶类、有机酸、酚类、色素、矿物质、水等[11-12],这些组份会干扰硫酸法测定木质素含量的准确度。洗涤剂法[13]在硫酸法的基础上做了一些改进,首先采用有机溶剂抽提除去烟草中的脂类等物质,然后采用酸性洗涤剂除去烟草中的糖类、脂肪、蛋白质以及半纤维素等成分,最后采用72 %的硫酸除去纤维素,剩下的固体即为烟草酸洗木质素。由于木质素在酸性条件下会发生一定程度的降解形成酸溶木质素,洗涤剂法测定木质素含量的过程忽略了酸溶木质素的测定,因此,采用洗涤剂法测定的烟草木质素的含量不能代表烟叶中总木质素的含量。

NaOH (LiOH)/尿素（硫脲）体系（一般是在-8～-12℃下的7%氢氧化钠和12%尿素水溶液）是武汉大学张俐娜院士团队发明的用于低温溶解纤维素、甲壳素及聚苯胺等顽固大分子的“绿色”溶剂[14-17]。深入研究[18]表明,NaOH/尿素低温溶解纤维素的机理是在低温下氢氧化钠水合物与纤维素上羟基通过氢键驱动自组装形成包合物,从而破坏纤维素原有的分子内和分子间氢键,由此把纤维素分子带入水溶液中,形成透明的纤维素溶液。除了纤维素,半纤维素和小分子的木质素也可以溶于低温的NaOH/尿素体系,但是与植物细胞壁联接的木质素网络却不溶于这个溶剂体系[19-20]。

本文基于低温的NaOH/尿素水溶液对纤维素、半纤维素等天然高分子的优越溶解能力,结合稀酸法打断烟梗中木质素与纤维素等组份之间的化学键连接,同时测定了酸溶木质素和酸不溶木质素的含量,建立了NaOH/尿素低温溶解法测定烟梗木质素含量的新方法。本文还优化了酸解工艺,评价了该方法的准确性和精确性。

1 实验部分

1.1 实验材料

原料和试剂：烟叶分别来自广东,四川和贵州三个地区,X2F等级烟梗由广东中烟工业有限责任公司技术中心提供。NaOH/尿素体系由质量分数8%的NaOH和12 %的尿素组成。硫酸,氢氧化钠和尿素均为分析纯,广州化学试剂厂。

1.2 氢氧化钠/尿素低温溶解法测定烟草木质素含量的实验原理和步骤

实验原理：首先采用纤维素溶解的最佳条件,将8 %氢氧化钠/12 %尿素水溶液在低温下（-10℃）对烟梗粉末进行抽提,除去其中的水溶性糖类物质等杂质；然后采用稀酸处理,打断木质素和半纤维素以及纤维素之间的连接键,并除去部分半纤维素和纤维素[21-22]；最后,再次使用第一步相同的条件,用氢氧化钠/尿素水溶液低温溶解纤维素和半纤维素,剩余的固体即是酸不溶木质素。

图1 氢氧化钠/尿素低温溶解法测定烟梗木质素含量流程图Fig.1 Procedure of determination of lignin content in tobacco stem by NaOH/Urea method

实验步骤：

（1）将待测烟梗样品在50 ℃下干燥24 h,磨粉（微型植物试样粉碎机,FZ102,河北省黄骅市齐家务科学仪器厂）,过筛（60目）,得到烟梗粉,并根据烟草行业标准（YT/C 31-1996）测定烟梗粉的含水量（记作W%）；

（2）称取一定量的烟梗粉(记作m1),以液固比25 mL·g-1加入到预先冷却至-10 ℃的氢氧化钠/尿素水溶液中,在-8～-12 ℃下搅拌30 min,用600目滤布抽滤得到滤液A,固体经水洗至中性即得预处理后的烟梗粉（固体A）；

（3）将固体A以液固比80 mL·g-1加入质量分数为17.5%的硫酸溶液中,在100 ℃搅拌反应30 min,离心分离,得到滤液B和固体B,滤液B用于测定酸溶木质素含量；将固体B水洗至中性,分别用100 mL丙酮洗涤3次后干燥。干燥后的固体加入100 mL已经预先冷却至-10 ℃的氢氧化钠/尿素溶液中,于-8～-12 ℃下搅拌30 min,采用600目滤布抽滤,得到滤液C和残渣,残渣经水洗至中性并用定量滤纸过滤,将滤纸和滤渣在105 ℃下干燥至恒重得到固体C。将干燥后定量滤纸和滤渣转移到坩埚中,放入马弗炉,在800 ℃下灼烧4 h,剩余固体即为烟草木质素中的灰分。通过灼烧前后质量之差再减去定量滤纸的质量即为烟梗酸不溶木质素的质量（记作m2）。

（4）取步骤（3）中的滤液B稀释25倍后测定在325 nm处的紫外吸光度,通过酸溶木质素标准曲线计算得到酸溶木质素的含量。酸溶木质素含量的计算公式如下：

式中,A325nm—滤液在紫外325 nm处的吸光度；

D—滤液的稀释倍数,25；

V—滤液的体积,L；

m1—烟梗样品的质量,mg。

将酸溶木质素的含量和酸不溶木质素的含量相加得到基于烟梗干基的木质素总含量。

1.3 紫外吸收光谱测试

将滤液稀释一定倍数后用紫外可见光谱仪（岛津UV-1601PC型）扫描,波长范围是190-700 nm,扫描间距为0.5 nm/1nm。

1.4 糖分测试

酸不溶木质素上联接的糖份酸解后用高效离子交换色谱测定。具体方法参照文献[23]：将烟草酸不溶木质素加入6%的硫酸溶液中,在105 ℃下反应2.5 h,过滤,将滤液的pH值调节到中性后稀释30倍,采用离子交换色谱（DIONEX ICS-3000）检测滤液中单糖含量。采用美国ANASTAR公司的色谱工作站；色谱分析柱：CarboPac PA1(2×250 mm)；保护柱：CarboPac PA1(2×50 mm)；淋洗液：0.001 mol NaOH- 0.05 mol NaAc；体积流量：0.650 mL·min-1; 进样体积：10 μL；柱温：30 ℃；检测器：脉冲安培检测器。可以分离测定阿拉伯糖、葡萄糖、木糖、甘露糖、半乳糖、葡萄糖酸和半乳糖酸等的含量。

2 结果与分析

2.1 氢氧化钠/尿素低温溶解法测定烟梗木质素含量的工艺分析

2.1.1 氢氧化钠/尿素低温预处理滤液的紫外吸收光谱分析

本文用NaOH/尿素体系在-10 ℃下抽提经干燥粉碎后的X2F烟梗以去除可溶性物质或者以氢键联接的细胞壁组成物质,流程如图1所示。抽滤得到滤液A的紫外吸收光谱如图2所示。从图2可见,经冷冻至-10 ℃的NaOH/尿素体系在211 nm和239 nm处有两个明显的吸收峰,在NaOH/尿素溶液中加入由麦草碱木质素经过进一步提纯的Klason木质素[6]后,木质素浓度为0.12 g·L-1,239 nm处的吸收峰明显增强；而滤液A和滤液C在240 nm附近没有明显的吸收峰。这表明滤液A和C中不含有木质素,也就是说NaOH/尿素体系对烟梗粉末的抽提过程不会使烟梗的的木质素溶出,不会影响烟梗木质素含量的测定。

图2 烟梗滤液A和滤液C的紫外吸收光谱图Fig.2 UV-vis spectra of filtrate A and C of tobacco stem treated by NaOH/urea method

另外,滤液A的紫外吸收峰蓝移以及240 nm吸收峰的消失可能与尿素分子和氢氧化钠水合物与烟梗溶出物形成包合物有关。因为尿素分子和氢氧化钠水合物可以通过氢键包合淀粉、醇类、有机酸等物质[18,24-26]。

2.1.2 酸解滤液的紫外吸收光谱分析

烟梗木质素在酸处理过程会部分降解溶于酸溶液中,这部分木质素被称为酸溶木质素。从图3可见,烟梗的酸处理滤液B的紫外吸收光谱在207 nm和278 nm处有两个吸收峰。由于纤维素和半纤维素在强酸条件下容易降解成羟甲基糠醛和糠醛[9-10,27],而糠醛在280 nm附近有很强的吸收峰,因此美国纸浆与造纸技术协会（Tappi）[8]、中华人民共和国国家标准[5]都选用205 nm附近的吸收峰来测定酸溶木质素含量。这种酸溶木质素的测定方法适用于木材及纸浆等原料,对于草类原料会产生较大的偏差[10]。由于烟叶富含酶等蛋白质和氨基酸,在酸性条件下蛋白质容易成氨基酸,而大部分氨基酸在小于220 nm区域有紫外吸收。如图3所示,牛血清蛋白稀酸溶液在200 nm附近有很强的吸收,因此对选用205 nm的紫外吸光度来测定酸溶木质素会产生干扰。为了减少糠醛、羟甲基糠醛及蛋白质等杂质的干扰,本文选用325 nm处的吸光度来测定酸溶木质素含量。

图3 滤液B、糠醛和BSA的紫外光谱图Fig.3 UV-vis spectra of filtrate B, furfural and BSA

图4 滤液B中酸溶木质素的标准曲线图Fig.4 The standard curve of acid soluble lignin in filtrate B

选取麦草碱木质素经过硫酸酸析过滤干燥得到粗木质素,为了制备纯度较高的木质素基准物,将粗木质素采用硫酸法[7]进一步除去纤维素和半纤维,过滤,50 ℃真空干燥24 h,并将其至于球磨机中球磨4 h,以增加木质素基准物在稀酸水解过程的酸溶木质素,球磨过后的麦草木质素作为制定酸溶木质素标准曲线的原料。标准曲线的过程为：将上述麦草木质素基准物溶于稀酸溶液中,以相同的稀酸水解工艺（硫酸浓度为17.5 %、液固比为80 mL·g-1、酸解温度为100 ℃、酸解时间为30 min）部分溶于酸中,通过失重法标定其质量浓度,用相同浓度的稀酸稀释后测定其在325 nm处的吸光度,根据木质素浓度和吸光度的关系拟合出酸溶木质素的标准曲线,结果如图4和式（2）所示,其中R2＝0.99948。

2.2 酸解工艺参数的优化

由于在植物细胞壁结构中,木质素与纤维素和半纤维素通过化学键形成木质素－碳水化合物的复合物（LCC）[28-30],因此必须打断木质素与碳水化合物之间的化学键才能使木质素得以分离,其中酸水解是常用的方法[28]。本文在固定酸解温度的前提下考察了酸浓度、酸解时间和固液比等因素对酸水解效果的影响。

2.2.1 酸浓度对木质素含量检测值的影响

首先固定硫酸和烟梗溶液的比例（液固比）是80 mL·g-1,反应温度是100 ℃,反应时间为30 min,考察硫酸浓度对烟梗木质素含量检测值的影响,结果如图5所示。

图5 硫酸浓度对烟梗木质素含量检测值的影响Fig.5 Effect of sulfuric acid concentration on determination of contents of acid-insoluble lignin and acid-soluble lignin in tobacco stem

从图5可以看出,当硫酸浓度从5 %增至17.5 %时,酸不溶木质素含量检测值从2.85 %降至1.50 %,说明随着硫酸浓度的增加,木质素和纤维素、半纤维素之间化学键不断地断裂,纤维素和半纤维素的去除越来越彻底；当硫酸浓度从10 %增至17.5 %,酸溶木质素含量检测值基本不变,说明这个过程木质素的降解没有加剧的趋势。Heitz等[31]研究表明,木糖的降解产物糠醛、乙酸等在湿解的条件下易于自身缩合,或同木质素缩合生成和木质素有相似组成的物质,常被称为“类木质素”,所以导致酸不溶木质素的质量分数增加。当硫酸浓度进一步增加到25 %时,酸溶木质素和酸不溶木质素含量都增大,这是因为随着酸浓度的增加,碳水化合物发生炭化的同时木质素的降解程度也变大了。

结果表明,针对烟梗木质素的测定,酸处理时硫酸的浓度应该为17.5 %。

2.2.2 酸解时间对木质素含量测定的影响

其次,在硫酸的浓度为17.5 %、反应温度是100℃、液固比为80 mL·g-1的条件下,考察了酸处理时间对烟梗木质素含量测定的影响,结果如图6所示。

图6 酸解时间对烟梗木质素含量测定结果的影响Fig.6 Effect of acid treatment time on determination of contents of acid-insoluble lignin and acid-soluble lignin in tobacco stem

从图6可以看出,随着酸处理时间的从15 min增加到30 min时,酸不溶木质素从1.9 %下降至1.3 %,说明这个过程木质素和半纤维素及纤维素之间的化学键不断发生断裂；随着酸处理时间从30 min延长至45 min,酸不溶木质素和酸溶木质素含量不再下降,说明半纤维素和纤维素去除比较完全；随着酸处理时间再延长至60 min,总木质素含量保持不变,说明在硫酸浓度为17.5%时烟草中的碳水化合物不会发生炭化,但是出现酸不溶木质素含量下降而酸溶木质素含量上升的现象,这是由于100 ℃下,17.5 %的硫酸会使木质素发生降解,因此酸处理时间以30～45 min为宜。

对比图5中优化条件下烟梗木质素的含量（2.72 %）,图6得到烟梗木质素含量（3.0 %）偏高,其原因是图6所用的液固比偏低,导致酸解不够充分。

2.2.3 酸解液固比对木质素含量测定的影响

在固定硫酸的浓度为17.5 %、反应温度是100 ℃、反应时间是30 min的前提下,考察了液固比对烟梗木质素含量测定的影响,结果如图7所示。

图7 酸解液固比对烟草木质素含量测定结果的影响Fig.7 Effect of liquid-to-solid ratio on determination of contents of acid-insoluble lignin and acid-soluble lignin in tobacco stem

从图7可以看出,当液固比从30 mL·g-1增至100 mL·g-1时,酸不溶木质素的含量从1.73 %降至1.46 %,酸溶木质素的含量从1.29 %增至1.32 %,总木质素含量从3.00 %降至2.77 %,说明液固比增加有利于纤维素和半纤维素等碳水化合物的水解,同时也促进了木质素的降解。当液固比从60 mL·g-1增至100 mL·g-1时,酸不溶木质素略有降低,酸溶木质素略有增加,而总木质素含量基本保持不变,因此确定酸解的液固比是 80 mL·g-1。

综合上述研究结果确定了优化的酸解条件为：硫酸浓度为17.5 %、液固比为80 mL·g-1、酸解温度为100 ℃、酸解时间为30 min。

2.3 NaOH/尿素低温溶解法的准确性和精确性分析

从图1分析可知,滤液A和滤液C中不含有木质素；滤液B中的酸溶木质素已经通过325 nm处的紫外吸光度来测定。因此,酸不溶木质素中的杂质含量将直接影响测试的准确性。为了测定氢氧化钠/尿素低温溶解法得到木质素中糖类物质的含量,首先将得到的固体C进行酸解,然后通过高效离子交换色谱测定其糖份含量,结果如表1所示。

表1 烟梗酸不溶木质素糖分含量Tab.1 The carbohydrate content in acid-insoluble lignin of tobacco stem

从表1可见,酸不溶木质素中葡萄糖含量为1.39 %,而半乳糖、木糖和甘露糖含量都低于仪器的检出限（＜0.14 %）,这说明氢氧化钠/尿素低温溶解法的工艺过程能够使烟梗中的纤维素和半纤维素去除较完全,酸不溶木质素中残留的纤维素和半纤维素很少。同时结合前文可知,由于木质素在NaOH/尿素抽提过程没有因为溶出而造成损失。因此NaOH/尿素低温溶解法测定的木质素含量是准确的。

在优化的酸解条件下,对同一个样品采用NaOH/尿素低温溶解法平行测定3次,实验结果和相对标准偏差（RSD）如表2所示。

表2 NaOH/尿素低温溶解法测定的烟梗木质素含量及相对标准偏差Tab.2 Lignin contents and relative standard deviations of tobacco stems measured by NaOH/urea method

从表2可以看出,对于同一地区而言,烟草植株上部烟梗的木质素含量都是最高,相对标准偏差均小于3 %,说明本方法的重复性好,具有很好的精密度。

3 结论

（1）本实验基于烟梗中纤维素、半纤维素等组份能溶于低温的NaOH/尿素体系的原理,首先采用氢氧化钠/尿素低温处理烟梗粉,然后通过稀酸水解法破坏烟梗中木质素与纤维素、半纤维素等碳水化合物的化学键,最后再次采用NaOH/尿素低温溶解的方法去除纤维素和半纤维素等组份得到酸不溶木质素。

（2）通过测定酸解液在325 nm的紫外吸光度测定酸溶木质素的含量,不但避免糠醛和羟甲基糠醛等在280 nm处的干扰,同时避免烟梗蛋白质等组份在205 nm附近的干扰。因此酸溶木质素的测定更加准确。

（3）通过实验研究确定了烟梗酸处理过程的优化参数：硫酸浓度为17.5 %、液固比为80 mL·g-1、酸解温度为100 ℃、酸解时间为30 min。

（4）NaOH/尿素低温溶解法测定烟梗木质素的含量准确性和精密度良好,减少了有机溶剂预处理和浓硫酸处理,提高了测试的安全性。

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Determination of lignin in tobacco stem by NaOH/urea dissolving method at low temperature

KONG Haohui1,LI Xiuli2,HUANG Yifei1,JI Kaibin2,3,LOU Hongming2,4,QIU Xueqing2,4,YANG Dongjie2
1 Technology Center, China Tobacco Guangdong Industrial Co., Ltd., Guangzhou 510385, China；
2 School of Chemistry and Chemical Engineering, South China University of Technology, Guangzhou 510641, China；3 Guangzhou Quality Supervision and Inspection Research Institute, Guangzhou 510110, China；
4 State Key Laboratory of Pulp and Paper Engineering, South China University of Technology, Guangzhou 510641, China

A novel method to determine lignin content in tobacco leaf stems was developed.Leaf stems were extracted by NaOH/urea aqueous solution at low temperature to remove saccharides and other impurities.Acid treatment was carried out to break chemical bonds between lignin and cellulose/hemicellulose and obtain acid-soluble lignin under optimized conditions, i.e.100℃ for 30min with sulfuric acid of 17.5 % and liquid-to-solid ratio of 80 mL·g-1.Residual was further treated by NaOH/urea aqueous solution to resolve highmolecular compound such as cellulose/hemicelluloses, and acid-insoluble lignin was thus obtained.Acid-soluble lignin was determined by UV absorbance at 325 nm,and acid-insoluble lignin was determined by combustion method.The RSD of lignin determination was below 3%.Organic solvent and concentrated sulfuric acid pretreatment was avoided, which improved the security of operations.

tobacco leaf stem; lignin; sodium hydrate/urea aqueous solution; dissolve at low temperature; acid treatment

10.3969/j.issn.1004-5708.2014.03.002

TS411 文献标志码：A 文章编号：1004-5708（2014）03-0009-07

广东中烟项目“烟草木质素的含量与结构特征研究”（粤烟工 [2011]科字第008号）

孔浩辉（1974—）,男,硕士,高工,主要从事烟草、烟用材料和香料香精分析与研究工作,Tel:020-81233858,Email:konghh@gdzygy.com

邱学青（1965—）,男,博士,教授,博士生导师,主要从事木质素的基础研究和资源化高效利用,Tel:020-87114722,Email:xueqingqiu66@163.com

2013-11-23