普陀樟SRAP-PCR反应体系的建立

2014-11-24吕昕谣赵国淼曾燕如宋绪忠

浙江林业科技 2014年3期

吕昕谣，赵颖，赵国淼，曾燕如*，宋绪忠，杨华

（1.浙江农林大学亚热带森林培育国家重点实验室培育基地，浙江临安 311300；2.浙江省舟山市林业科学研究院，浙江舟山 316000；3.浙江省林业科学研究院，浙江杭州 310023）

普陀樟（Cinnamomum japonicumvar.chenii）系樟科樟属常绿乔木，为舟山海岛特有濒危植物。集中分布在舟山市普陀区的普陀山、朱家尖及其毗邻的悬水小岛上，除此之外的其他区域均未见有该树种的天然分布[1]。普陀樟木材坚实致密，纹理通直，耐腐，耐水湿，是优良的用材树种；且根系发达，抗风性强，且兼具耐盐碱、耐干旱瘠薄等特性，适应性广，非常适宜沿海地区栽种。而目前却缺乏对野生普陀樟致濒原因等各方面的足够了解，难以实施有效的遗传保育。

相关序列扩增多态性（Sequence-related amplifiedpolymorphism, SRAP）是Li和Quiros[2]开发的分子标记技术，该技术通过独特的引物设计对开放阅读框（Open reading frames, ORFs）进行扩增，因个体不同以及物种的内含子、启动子与间隔区长度不等而产生多态性[3]。Ferriol等[4]在观赏南瓜（Cucurbita moschata）中利用SRAP和AFLP两种分子标记进行遗传多样性实验，结果与AFLP标记相比，SRAP标记结果更接近其性状变异。Budak[5]等对野牛草（Buchloe dactyloides）进行ISSR（Inter-simple Sequence Repeat）、SSR（Simple Sequence Repeat）、RAPD（Random Amplified Polymorphic DNA）和SRAP等4种分子标记的遗传多样性研究，结果SRAP表现出更丰富的遗传多样性，是区分能力最强的标记。与其他分子标记相比，SRAP标记技术具有重复性好、多态性高、操作简便、共显性、易测序、引物具有通用性等优越性，已逐渐成为种质资源研究的有效技术，近年来多应用于遗传多样性分析[5]、遗传图谱构建[6]以及重要性状标记[7]等诸多领域。

目前，有关普陀樟分子标记方面的研究尚未见报道。本研究建立了普陀樟的SRAP-PCR反应体系，可为进一步开展普陀樟的遗传多样性及相关遗传研究提供技术支撑，也可为普陀樟基因组分析、分子标记辅助育种等奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

新鲜健康的普陀樟叶片样品7份采自舟山群岛不同岛屿，带回实验室后清水洗净，放置－40℃冰箱保存待用。

表1 SRAP 引物序列Table1 Sequences of SRAP primers

Taq DNA聚合酶（5U/μL）购自上海申能博彩生物科技有限公司；dNTP、DNA Marker（Fermentas）、SRAP 引物（表1）等均购自生工生物工程（上海）有限公司。

1.2 方法

1.2.1 基因组DNA的提取与检测采用改良CTAB方法结合TNE的方法[8]提取普陀樟基因组DNA。提取的DNA用1.0%琼脂糖凝胶电泳检测DNA的完整性，用紫外分光光度计（NanoDrop 1000 Spectrophotometer，美国）测定A260、A280，并计算两者的比值，以检验DNA的质量，并根据测定的浓度将DNA稀释到10 ng/μL，－20℃保存备用。

1.2.2 SRAP-PCR反应体系的建立基于刘浩凯等优化的适用于榧树的SRAP分析方法（含PCR产物电泳）[9]采用L16（45）正交试验设计，对可能影响普陀樟SRAP-PCR反应的Mg2+浓度、dNTPS、Taq DNA聚合酶、引物（F2/R4）和模板DNA用量进行5因素4水平正交试验（表2）。反应总体积为20 μL，实验重复4次，以确定最佳体系组合。

表2 SRAP-PCR正交设计试验L16（45）Table2 L16（45）orthogonal design for SRAP-PCR reaction

反应程序为94℃预变性5 min；共5个循环，每个循环94℃变性45s，35℃退火45s，72℃延伸1 min；随后35个循环，每个循环94℃变性45 s，50℃退火45s，72℃延伸1 min；最后72℃延伸5 min，4℃保存。扩增产物加入3 μL Loading dye混合均匀，以3 000 bp DNA Ladder为参照标准，采用8%非变性聚丙烯酰胺凝胶进行电泳，160V电泳85 min。电泳结束后采用银染法进行染色，显色后将凝胶置于可见光灯箱上观察电泳结果，并拍照保存。

随机选取F6/R7和F6/R8两个引物组合，利用筛选出的普陀樟最优体系，对30份普陀樟DNA材料进行PCR扩增，检测反应体系的稳定性。

利用优化设计确定的SRAP-PCR的最佳反应体系，用表1所示的10个正向引物和10个反向引物组合的100对引物，对4个不同普陀樟样品进行引物组合筛选。

2 结果与分析

2.1 普陀樟基因组DNA的提取

经紫外分光光度计测定，8份普陀樟DNA样品OD260/OD280值均在1.8 ～ 2.0；1%琼脂糖电泳检测结果（图1）显示，DNA条带完整清晰，无拖尾现象，符合分子标记扩增对DNA的要求。

图1 普陀樟DNA的琼脂糖电泳检测图Figure1 Argarose electrophoretogram of genomic DNAs extracted in C.japonicum var.chenii

2.2 SRAP-PCR反应体系的优化

从正交实验结果可以看出，不同的PCR组份组合扩增效果具有明显的差异，其中1 ～ 4、7、8号扩增效果不好，11、12、15、16号位点较清楚，但位点数少，均予以淘汰（图2）。仔细观察发现，9、10号比13、14号扩增的位点数多，而且更加清晰。直观分析10号组合为佳，9号组合次之，二者间无明显差异。虑到9号组合中 Taq 酶的用量为 2 U，因此本着经济有效的原则，最终确定10号组合为最理想的SRAP-PCR反应体系，即20 μL PCR体系包括 2.5 mmol/L Mg2+、0.2 mmol/L dNTPs、1.5 U Taq DNA聚合酶、0.4 μmol/L引物、10 ng模板DNA、2 μL 10×PCR buffer。

图2 正交实验产物电泳图Figure2 Electrophoretogram of PCR products based on the orthogonal design

2.3 SRAP-PCR体系的稳定性检测及引物筛选

SRAP-PCR体系的稳定性检测表明，扩增谱带清晰而稳定，位点数多，且多态性丰富（图3），说明建立的反应体系具有良好的稳定性，适合于普陀樟的SRAP-PCR分析。利用该反应体系，从100对引物组合（表1）中筛选出20对扩增产物清晰、多态性较好的引物（F2R7、F3R7、F4R7、F5R7、F6R7、F8R7、F9R7、F5R1、F5R8、F6R8、F9R6、F2R1、F4R2、F5R1、F5R2、F3R3、F4R3、F6R4、F10R4、F5R5），用于普陀樟后续遗传多样性分析。

图3 SRAP反应体系稳定性检测（引物对：上：F6R7；下：F6R8）Figure3 Testing of the SRAP reaction (Primer pairs: F6R7 (up) and F6R8(down))

3 结论与讨论

SRAP分子标记是基于PCR反应的一种标记技术，它的结果受到体系中各个因素的影响，且各因素之间还存在相互作用，因此各因素之间的配比只有达到最佳状态时，才能得到稳定、可重复的扩增结果。不同植物适合的SRAP 反应体系不同，所以需要根据物种的不同对反应体系进行优化。

本实验采用了一次性正交实验设计筛选反应体系，并对该体系稳定性进行了检测及初步应用，结果显示扩增位点清晰稳定，多态性好，重复性强，说明本研究建立的普陀樟SRAP-PCR体系稳定可靠、扩增效率高，为日后普陀樟基因组分析、分子标记辅助育种、遗传多样性研究等奠定了基础。

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