小鹅瘟与烟曲霉性肺炎混合感染的诊断

张 双，柏亚铎，胡桂学

（1.吉林农业大学动物科学技术学院，吉林 长春 130118；2.北京出入境检验检疫局，北京 朝阳 100026）

1 发病情况

吉林省舒兰县两家养殖户分别饲养2 000羽和1 200羽10日龄雏鹅，在2013年6月份，相继死亡300羽和200羽，死亡率高达20%。此前，该鹅场未曾有过相关疫情。该两家养殖户均通过炕房孵育，在出壳后注射小鹅瘟高免血清，7 d后没有注射小鹅瘟疫苗。由于2013年6月份雨季下雨比较多，导致饲料和垫料都比较潮湿，饲料结块，垫料有明显的发霉味。随后，两家养殖户将10羽10日龄的患病鹅送至本实验室诊断。

2 临床症状

病鹅精神沉郁，羽毛松乱，食欲不振，饮欲增加，垂头缩颈，走路缓慢，排灰白或淡黄绿色稀粪，便中带有纤维状碎片和气泡。病鹅离群，发育迟缓，渐进性消瘦，站立不稳，随着病情的发展，患病雏鹅呼吸困难，呼吸频率加快，但没有发出明显的啰音。

3 病理剖检

病鹅的病变部位主要位于空肠和回肠，呈现卡他性纤维素性坏死性肠炎，肠道出现明显的充血、肿胀、肠黏膜坏死、脱落，内容物形成栓塞，类似于香肠（见中插彩版图1），在肺脏和气囊上有针尖或粟粒状白色或黄色结节（见中插彩版图2），切开后有黄白色干酪样渗出物。

4 细菌学检测

4.1 光学显微镜观察 取病鹅的肺部结节，涂片，滴加两滴10%KOH溶液(1.000 g加入10 mL的蒸馏水中)，在显微镜下观察，可见大量的菌丝和孢子（见中插彩版图3）。

4.2 细菌分离与鉴定 将病鹅肺脏病料进行划线培养，接种于固体沙堡劳培养基，置于30℃，培养12 h后观察，结果（见中插彩版图4），挑取单一菌落接种于液体沙堡劳培养基，180 r/min，（28℃），振荡培养12 h。

图1 肠道内容物栓塞如箭头所示

图2 气囊上的白色结节

图3 真菌镜检结果

图4 细菌分离结果

参照宝生物工程（大连）有限公司的TaKaRa试剂盒操作说明书，提取培养菌的DNA，稀释100倍做为模板，引物参照李建侠等（2011）设计并由上海生工生物工程技术服务有限公司合成，序列如下：

上游引物ITS1-F：5′-TCCGTAGGTGAACCTGC GG-3′；

下游引物ITS2-R：5′-GCTGCGTTCTTCATCGA TGC-3′。

反应体系如表1：

表1 PCR鉴定烟曲霉菌反应体系

反应程序：95℃预变性5 min；94℃变性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸1 min，35个循环；72℃终延伸10 min。用1%琼脂糖凝胶电泳，观察PCR扩增片段的大小。

5 病毒学检测

5.1 病毒分离培养 无菌采取疑似感染小鹅瘟病毒雏鹅的肝脏进行研磨，按1∶5的比例加入3 mL生理盐水，5 000 r/min（4℃）离心 5 min，取上清，反复冻融3次，加入1%的双抗至最终浓度为1 000 IU/mL，置于37℃感作30 min，接种于4枚11日龄的非免疫鹅胚，每枚鹅胚接种0.2 mL，同时设置对照组，对照组为2枚鹅胚，分别接种0.2 mL的生理盐水，置于37℃孵化。每隔6 h观察一次，弃去在24 h内死亡的鹅胚，收获24 h至96 h死亡鹅胚的尿囊液。

5.2 病毒的鉴定 将收获的尿囊液稀释100倍作为模版，引物参照胡桂学等（2003）[2]，设计并由上海生工生物工程技术服务有限公司合成，序列如下：

GPV-F：CCAAGCTACAACAACCACATCTAC；

GPV-R：CTGCGGCAGGGCATAGACATCCGAC

反应体系如表2。

反应程序：95℃预变性5 min；94℃变性30 s，54℃退火30 s，72℃延伸1 min，35个循环；72℃终延伸10 min。1%琼脂糖凝胶进行核酸电泳，观察PCR扩增片段的大小。

表2 PCR鉴定鹅细小病毒（GPV）的反应体系

6 结果

PCR结果:经1%琼脂糖凝胶电泳分析其目的片段为375 bp，鉴定为小鹅瘟病毒；PCR结果:经1%琼脂糖凝胶电泳分析，其目的片段为264 bp鉴定为烟曲霉。见图5、6。

7 讨论

通过对舒兰县两家鹅场的发病情况、临床症状及病例剖检等观察，结合实验室诊断，确诊该病鹅为鹅细小病毒与烟曲霉菌性肺炎的混合感染。

鹅细小病毒主要是感染3～30日龄的雏鹅，主要在5～20日龄内发病，30日龄以上的雏鹅不易发病，所以小鹅瘟主要是呈周期性流行。烟曲霉易发生于春季，由于雨水比较多，气候潮湿，导致家禽的饲料和垫料潮湿，再加温度，酸碱度等原因，使其大量发霉，而鹅通过呼吸进食等吸入大量的真菌孢子，感染发病。

病例通过发病情况，临床症状，病例剖检及PCR检测，鉴定为为鹅细小病毒与烟曲霉性肺炎的混合感染。初步推测由于吉林省舒兰县养殖户管理饲养等不当，在雏鹅刚出壳后感染小鹅瘟病毒，由于5、6月份雨季下雨比较多，养殖舍及饲料等潮湿，使雏鹅继发生霉菌的混合感染。

由于鹅细小病毒是垂直传播，所以应对母鹅进行免疫接种，在母鹅产前15～30日龄和产后的15～20日龄应分别注射小鹅瘟病毒疫苗，每羽1 mL。母鹅在产后3～10周内产蛋和所孵雏鹅对小鹅瘟具有免疫力。对于发病鹅群应及时接种小鹅瘟高免血清，发病鹅每只注射1.5 mL，有较好治疗效果。烟曲霉对于制霉菌素具有一定的敏感性，应及时对健康鹅进行口服预防，防止其产生混合感染。

加强饲养管理，严格进行消毒，在种蛋入孵前，对种蛋及孵化室、所有器具用福尔马林或复合粉进行消毒，禁止使用霉变的饲料，及时降低饲料的堆放密度，加强通风，防止舍内过于潮湿，平时一定注意环境卫生及防疫。

[1]李建侠，刁有祥，国纪磊，等.肉鸭烟曲霉菌的分离与鉴定[J].中国家禽，2011，33（18）:56-57.

[2]胡桂学，逄博，高凤山，等.小鹅瘟PCR诊断方法的建立和初步应用[J].经济动物学报，2003，7（2）:50-53.