布鲁氏菌A、M因子血清的研制

张金亚，程君生，冯 宇，丁家波，王 楠，皮向成，吴 竞，张东东，朱良全∗，毛开荣∗

（1.中国兽医药品监察所，北京100081；2.山东农业大学动物科技学院，山东泰安271018；3.中国农业科学院北京畜牧兽医研究所，北京100193）

布鲁氏菌是革兰氏阴性、胞内寄生兼性需氧菌，可导致多种动物和人患布鲁氏菌病（布病），造成严重的公共卫生问题和经济损失。布鲁氏菌目前分为6种陆生、4种海洋布鲁氏菌［1-2］。牛种布鲁氏菌、羊种布鲁氏菌、猪种布鲁氏菌是流行广泛的经典布鲁氏菌［3-5］。

1932 年Wilson和Miles提出布鲁氏菌A、M抗原决定簇的假设。经试验证实S-LPS含四种抗原决定簇：A、M、C、C／Y，并根据A 和M 比例，分为 A、M、C（M＞A）、C（M＝A）、C／Y（M＞A）、C／Y（M＝A）、C／Y（A＞M）等 7 类［6-7］。

田间布鲁氏菌血清学检验时，菌株间交叉反应会影响布病病原的鉴别诊断。通过A、M因子血清，可辅助布病病原的种属鉴别。Pandit等［8］提出了血清与异种抗原交叉吸收的方法，Jones等［9］用活菌2308株和 16M 株、Wilson等［10］用活菌 A544株和16M株制备过因子血清，但国内未见制备因子血清的文献报道。本试验选用灭活的16M株和2308株布鲁氏菌免疫家兔制备了A、M因子血清，并优化了交叉吸收条件。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株及来源 牛种布鲁氏菌2308株（CVCC788）、羊种布鲁氏菌 16M 株（CVCC70002）均来自国家兽医微生物菌种保藏中心。

1.1.2 主要试剂和仪器 大豆酶消化蛋白胨琼脂（Tryptic Soy Agar，TSA）培养基，购自BD公司。布鲁氏菌病试管凝集试验抗原参考品（简称“抗原参考品”） ，规格：5 mL／瓶，批号：S0100220130312；布鲁氏菌病阳性血清，规格：1 mL／瓶，批号：2001-5；布鲁氏菌病试管凝集试验阴性血清，规格：1 mL／瓶，批号：2001-5；均由中国兽医药品监察所人畜共患病实验室提供。16M试管凝集试验抗原、2308试管凝集试验抗原（简称“16M抗原、2308抗原”）按照《兽用生物制品规程》（2000年版）制备［11］。疫苗佐剂（纳米703佐剂）由北京生泰尔生物科技有限公司提供。

1.1.3 实验动物 1.5～2 kg雄性新西兰大耳白兔，普通级，购自北京维通利华实验动物技术有限公司。

1.2 方法

1.2.1 高免血清的制备

1.2.1.1 种子制备 取2308、16M菌株冻干用菌种各1支，分别启封后，用1 mL蛋白胨水稀释，参考OIE方法［12］划线接种TSA琼脂平板各2块，37℃培养72 h，低倍显微镜观察各平板菌落形态，选取10个各典型菌落分别划线接种TSA琼脂斜面3支，置2～8℃保存不超过1个月，备用。

1.2.1.2 细菌悬液及灭活疫苗的制备 分别将各布鲁氏菌菌株密集划线接种于TSA琼脂扁瓶，置37℃培养48～72 h，每个扁瓶用3～5 mL 0.5%的苯酚生理盐水冲洗培养物制成悬液，经4层灭菌纱布过滤，去除残留琼脂。其余菌液80℃水浴2 h灭活［12］。灭活菌液用灭菌生理盐水洗涤3～4次后，重新悬浮，调整菌液浓度至 1.2×1011CFU／mL。取适宜体积的该浓度的菌悬液与纳米703佐剂按2∶1比例（V∶V）制成灭活佐剂苗。

1.2.1.3 动物免疫及血清抗体消长规律监测 以6×1010CFU／只颈背部皮下分点注射1.5～2 kg家兔各5只。一免后40 d，以2倍剂量进行二免。二免5 d后，耳缘静脉采血，2 mL／次，常规方法分离血清并用微量试管凝集试验（MAT）监测抗体效价消长规律。MAT试验参照OIE法［12］进行，将待检血清用0.5%苯酚生理盐水作1∶10倍稀释，然后倍比稀释至1∶5120，在96 U孔凝集板中加入待检血清50 μL，然后分别加入用0.5%苯酚生理盐水作1∶20稀释的抗原参考品、16M抗原和2308抗原，37℃孵育22 h，观察结果，并设立阴、阳性血清对照。

1.2.2 单因子血清的制备

1.2.2.1 血清交叉吸收条件的优化 将布鲁氏菌菌液用PBS缓冲液洗涤2～3次，8000 r／min离心15 min，弃上清，然后将待吸收血清与吸收用抗原充分混合。制备因子血清的交叉吸收体系见表1。

表1 血清抗原交叉吸收体系

按以下3组单项参数进行血清交叉吸收条件的优化：（1）异种抗原／血清质量体积比（W／V）分别为1 ∶5、1 ∶10及 1 ∶20；（2）吸收温度及时间分别为4℃吸收2 h、4℃吸收12 h及37℃吸收2 h；（3）吸收过程中混匀方式分别采取每20 min混匀1次以及130 r／min振荡孵育。

1.2.2.2 血清交叉吸收后凝集价的测定 吸收后的菌液以 8000 r／min离心 15 min，弃菌体。按1.2.1.3项方法通过MAT检测血清对抗原标准品、16M抗原和2308抗原的抗体反应效价，比较分析并确定最适单因子血清制备参数。

1.2.2.3 最佳反应稀释浓度的确定 取经灭菌生理盐水适当稀释的因子血清30 μL，加入30 μL凝集试验抗原进行玻片凝集试验，以1～2 min内出现凝集判为阳性，判定单因子血清对16M抗原和2308抗原的反应情况，从而确定最佳反应稀释浓度。

1.2.3 血清分装、冻干及鉴定 将优化条件下制取的A、M因子血清，加入适量硫柳汞，使其终浓度为0.01%。按1 mL／瓶分装、冻干。

1.2.3.1 无菌检验 随机取冻干血清3瓶，每瓶用1 mL灭菌生理盐水溶解后，按现行《中国兽药典》进行无菌检验［13］。

1.2.3.2 特异性检验 任取1瓶冻干因子血清，按照1.2.2.3的方法进行特异性检验。观察并记录结果。

1.2.3.3 效价测定 参考OIE方法［12］，采用抗原参考品、16M抗原、2308抗原进行MAT试验。

2 结果与分析

2.1 家兔抗体效价变化情况 分别用抗原参考品、2308抗原、16M抗原监测2308株和16M株免疫的家兔的抗体消长规律，结果见图1。可以看出，对2308试验组，三者测得的抗体变化趋势基本一致；对16M试验组，16M抗原与抗原参考品监测得到的抗体效价消长规律一致，且与2308试验组相似，基本表现为一免后20 d抗体效价处于较高水平，随后开始下降，到二免前（首免第40 d）已经明显下降到较低水平，二免后5 d抗体水平显著上升，15日抗体水平达到较高水平，随后下降。由于2308抗原与16M抗血清的反应性不佳，故用2308监测16M抗体产生规律时，其结果偏离以16M或以抗原参照品监测的结果（图1）。

图1 家兔抗体消长图

2.2 血清中抗体的交叉吸收

2.2.1 血清吸收条件的优化 以用16M抗原吸收兔抗2308血清为例，按表2的吸收条件分别进行预实验。吸收前兔抗2308血清对抗原参考品、16M抗原、2308抗原的凝集价分别为1∶1280、1∶320、1∶640。血清交叉吸收后用MAT测吸收后血清对抗原参考品、16M抗原、2308抗原的凝集价，结果见表2。

表2 血清吸收条件的方法优化及结果

比较血清交叉吸收后的对不同抗原的凝集价，确定当抗原与血清质量体积比（W／V）为1∶5时，37℃水浴2 h，期间每隔20 min振荡混匀1次为最适交叉吸收条件。

2.2.2 血清交叉吸收后凝集价的测定 经优化条件制备得单因子血清后，对因子血清进行特异性的鉴定，结果见表3和表4。

表3 因子血清对参考抗原及同种抗原的凝集价（MAT）

表4 因子血清对异种抗原的凝集价（MAT）

MAT结果显示：A因子血清对抗原参考品和2308抗原的凝集价均为1∶320（++），对16M抗原凝集价为1∶2.5不凝集；M因子血清对抗原参考品和16M抗原的凝集价均为1∶160（++），对2308抗原的凝集价为1∶2.5为凝集。

2.2.3 因子血清最佳稀释倍数的确定 经优化条件制备得因子血清后，对因子血清进行最佳稀释倍数的确定，结果见表5。

表5 因子血清稀释倍数的确定

玻片凝集试验显示，A因子血清对16M抗原在1∶1时无凝集，对2308抗原在1∶16时有较明显凝集颗粒，1∶32稍凝集；M因子血清对2308抗原在1∶1时无凝集，对16M抗原在1∶16时有较明显凝集颗粒，1∶32稍凝集。因子血清对异种抗原在血清原倍的情况下已无凝集现象，但仍建议在进行玻片凝集试验时对血清进行1∶2的稀释。

2.3 单因子血清的鉴定 对经分装冻干的因子血清进行无菌检验，证实无菌。经MAT检测因子血清冻干后对不同抗原凝集价，结果显示：分装冻干后的A因子血清对2308抗原的凝集价为1∶320（++），对16M 抗原为 1 ∶2.5不凝集；M 因子血清对16M抗原的凝集价为1∶160（++），对2308抗原的凝集价为1∶2.5不凝集；与冻干前凝集价比较，发现冻干对A因子血清和M因子血清对抗原的的凝集价无影响。经玻片凝集试验测定血清的最佳稀释比例，结果显示：分装冻干后的A因子血清对16M抗原在1∶1时无凝集，对2308抗原在1∶16时有较明显凝集颗粒，1∶32稍凝集；分装冻干后的M因子血清对2308抗原在1∶1时无凝集，对16M抗原在1∶16时有较明显凝集颗粒，1∶32稍凝集；与冻干前比较，发现冻干对A因子血清和M因子血清的最佳稀释比例无影响。

3 讨论与小结

3.1 最适吸收条件的确定 参照文献报道的因子血清交叉吸收条件［8-10］并进行了优化。本试验选用37℃和4℃两种温度，2 h和12 h两种时间，1∶5、1∶10、1∶20三种抗原血清质量比，以及恒温摇床振荡及每20 min振荡混匀两种孵育模式分别进行了试验，对比吸收后因子血清的抗体效价及对同种抗原、异种抗原的反应情况，最终确定在抗原与血清质量体积比（W／V）为1∶5时，37℃水浴2 h，期间每隔20 min振荡混匀1次为最适宜的吸收条件。

3.2 最适采血时间的确定 文献报道活菌一免后6 d，不经二免，最适宜采血并进行交叉吸收［9］。但试验发现，如免疫后较短时间内采血，此时血清对异种抗原的凝集价相对较低，但血清的抗体效价并不很高，经异种抗原交叉吸收后对同种抗原的凝集价也较低（1∶80左右）［10］；而二免后抗体效价上升，尽管血清对异种抗原凝集价升高，但血清经交叉吸收后对同种抗原的凝集价较高（1∶160和1∶320），故建议先获得高免血清（≥1∶2560），再进行血清的交叉吸收。

3.3 本试验的优点 以往制备因子血清大都采用活菌免疫［8-10］，而本试验选用灭活的 16M株和2308株免疫家兔，操作安全。对比文献制备的因子血清与试验制备的因子血清发现，试验制备的因子血清特异性更强，抗体效价高。

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