影响注射用白油佐剂免疫效果的因素分析

武桂梅，刘纯德，王振辉∗，慈洪波，刘 军

（1.吉林农业科技学院制药工程学院，吉林吉林132101；2.吉林市吉化江城油脂化工有限公司，吉林吉林132012；3.吉林正业生物制品股份有限公司，吉林吉林132101）

目前，国内外矿物白油乳剂灭活疫苗在注射过程中出现黏稠度较大、注射困难、毒副反应较强（过敏）、引起注射部位红肿、化脓等现象，这与白油佐剂的质量有一定相关性［1］。 Fukanoki［2-3］等用 3 种馏分分布各不相同的矿物油制备的新城疫和传染性支气管炎疫苗作了对比实验，发现含C20以上馏分较多的矿物油抗体效价较低，而含C16以下馏分较多者副作用比较明显，而馏分主要集中在C16～C20之间的抗体效价最高而且副作用比较小。鉴于此，课题在前期研究基础上，以免疫效果较好的进口注射用白油的馏分烃类组成及含量为参照依据，调整链烷烃和环烷烃的比例，制备出3批注射用白油制品。经过免疫效果试验，对影响注射用白油佐剂免疫效果的因素进行分析，为兽用生物制品行业选用注射用白油，提高油乳剂灭活疫苗免疫效果试验提供一定的参考。

1 材料与方法

1.1 白油参照品 国内白油（20130104GN1、20130203GN2）和进口白油（20130301GW1、20130402GW2）各2000 mL，均由吉林市吉化江城油脂化工有限公司提供。

1.2 病毒液与标准血清 合格的新城疫病毒灭活液5000 mL、标准新城疫抗原（20130101）、标准新城疫阳性血清（20130204）、标准阴性血清（20130101）均由吉林正业生物制品股份有限公司提供。

1.3 培养基和试剂 硫乙醇酸盐（T·G）、酪胨琼脂（G·A）、葡萄糖蛋白胨水（G·P）等常用培养基由学院生物制药实验室制备和保存；吐温-80、司本-80、硬脂酸铝，吉林正业生物制品股份有限公司。

1.4 试验鸡 30日龄SPF鸡、未经任何疫苗免疫健康的30日龄伊莎褐雏鸡，经监测新城疫血清抗体（HI）低于1∶4，均购于吉林正业生物制品股份有限公司健康实验动物中心。

1.5 白油制备 吉林市吉化江城油脂化工有限公司参照国外白油GW1馏分烃类组成及含量，改进生产工艺制备不同链烷烃和环烷烃含量的3批白油制品（20130401JH1、20130402JH2、20130403JH3）。

1.6 白油质量检测 吉林市吉化江城油脂化工有限公司按照《中华人民共和国兽药典》的有相关规定方法［4］进行。

1.7 白油馏分烃类组成及含量测定 白油样品馏分烃类组成及含量、正碳数分布及其含量由吉林化学工业公司石油研究院检测分析。

1.8 新城疫灭活疫苗制备与检验 白油样品按照《中华人民共和国兽用生物制品规程》鸡新城疫灭活疫苗制造与检验规程进行，分别进行油相制备、水相制备，油水比例为2∶1，用小型胶体磨10000 r／min乳化，每个白油样品制备油乳剂灭活疫苗各2000 mL。每个白油样品灭活疫苗按照《规程》标准进行物理性状及黏度检验、无菌检验、效力检验、安全检验。

1.9 微量免疫效果试验 白油样品新城疫灭活疫苗分别以20μL／只剂量颈部皮下注射 SPF鸡 10只，分别于接种免疫后 21、35、49、63、77、91 d 进行翅膀下静脉无菌采血分离血清检测HI效价［5］。

1.10 高剂量免疫效果试验 白油样品新城疫灭活疫苗分别以0.5 mL／只剂量胸部肌肉接种30日龄伊莎褐雏鸡30只，分别于接种免疫后15、30、45、60、75、90 d进行随机抽样5只，无菌采血分离血清检测HI效价，剖检疫苗注射部位，观察药物残留吸收情况［6］。

2 结果与分析

2.1 白油样品质量检测结果 除了酸度、易炭化物、固形石蜡、硫化合物、气味、颜色（赛氏号）、倾点℃、闪点（开口℃）、折光率（25℃）等数据均符合（兽药典三部）标准外。相对密度、运动黏度、稠环芳烃含量、重金属含量数据见表1。

表1 白油样品质量检测结果

从表1可知，运动黏度从高到低的顺序是GN2＞GN1＞GW1＞JH2＞JH3＞JH1＞GW2；稠环芳烃含量从高到低的顺序是 GN1＞GW2＞JH3＞GN2＞JH1＞JH2＞GW1；重金属含量超过百万分之十的是国内参考样品GN1和国外的GW2、GW1参考样品。

2.2 白油样品馏分烃类组成及含量分析结果 见表2。

表2 白油样品烃类组成及含量分析数据表 %

由表2数据分析结果可知：链烷烃含量国内白油比参照进口白油平均低0.1%；一环烷烃含量国内白油比参照进口白油平均高4.57%；二环烷烃含量国内白油比参照进口白油平均低2.43%；三环烷烃含量国内白油比参照进口白油平均低1.42%；总环烷烃含量国内白油比参照平均高0.72%；总饱和烃含量国内白油比参照进口白油平均高0.62%。杂质含量最高的是GW2为3.9、最低的是JH1为0.24，杂质含量从高到低的顺序是GW2＞GN2＞GW1＞GN1＞JH2＞JH3＞JH1。

2.3 白油样品主要正碳数分布分析结果 见表3。

表3 白油样品正碳数分布的质量百分数分析数据表 %

由表3数据结果统计可知：C12～C15含量国内白油比参照进口白油平均低1.96%；C16～C20含量国内白油比参照进口白油平均低13.6%；C21～C26含量国内白油比参照进口白油平均低0.19%；C12～C26含量国内白油比参照进口白油平均低15.78%。

2.4 白油样品制备的灭活疫苗检验结果 见表4。

表4 白油样品新城疫灭活疫苗制备的检验结果

可以看出，制备的7种灭活疫苗各项检验全部合格，其平均免疫抗体高低的顺序是JH2＞GW1＞GN2＞JH1＞JH3＞GN1＞GW2。

2.5 微量免疫抗体消长结果 不同免疫日龄HI抗体几何平均效价消长检测结果见图1。

由图1抗体消长数据曲线可知：国内白油和进口白油样品佐剂效果差异较大，免疫至91天时，白油样品JH2平均血清抗体最高为26.95，白油样品JH3平均血清抗体最低为25.82，白油样品平均血清抗体消长数据高低的顺序是JH2＞GW1＞GN2＞GN1＞JH1＞GW2＞JH3。

2.6 高剂量免疫抗体消长结果 不同免疫日龄HI抗体几何平均效价消长监测结果见图2。

由图2抗体消长数据曲线可知：国内白油和进口白油样品佐剂效果差异较大，免疫至90天时，白油样品JH2平均血清抗体最高为28.63，白油样品JH3平均血清抗体最低为27.77，白油样品平均血清抗体消长数据高低顺序是 JH2＞GW1＞JH1＞GN1＞ GN2＞GW2＞JH3。

图1 白油样品灭活疫苗20 μL免疫血清抗体效价消长曲线

图2 白油样品灭活疫苗0.5 mL免疫血清抗体消长曲线

2.7 高剂量免疫注射部位剖检药物残留量结果不同免疫日龄药物残留量结果见表5。

表5 白油样品新城疫灭活疫苗注射部位剖检药物残留量结果

从表5结果看出，不同免疫日龄药物吸收与残留的情况各不相同，白油佐剂吸收快，残留量由少到多的顺序是 GN2＞JH3＞JH2＞GW1＞JH1＞GN1＞GW2。综合微量免疫和高剂量免疫抗体效价消长检测结果，以及注射部位剖检药物残留情况，白油样品佐剂免疫效果高低的顺序是JH2＞GW1＞JH1＞GN2＞GN1＞GW2＞JH3。

3 讨论

目前，研究矿物白油佐剂免疫效果的文献报道不多，最适用的研究方法是制备新城疫灭活疫苗或禽流感灭活疫苗免疫健康鸡，采用血凝抑制试验检测血清抗体效价，剖检注射部位，观察药物残留吸收情况，对分析影响矿物白油佐剂免疫效果的因素，及筛选免疫效果较好的矿物白油是必不可少的的试验方法。

如果矿物油精制深度不够，多环芳烃的含量就会超过残留限量，动物免疫后残留在畜禽体内造成潜在的食品安全问题［7］。通过对白油样品质量标准检测数据分析，国内白油样品GN1稠环芳烃和重金属含量超标，国外白油样品GW2、GW1重金属含量超标。通过对白油样品的烷基苯、总单环芳烃、苊烯类、三环芳烃、总双环芳烃等杂质含量检测数据分析，杂质含量最高的是国外白油样品GW2，其次是国内白油样品GN1；三环芳烃含量最高的是国内白油样品GN1，总芳烃含量最高的是国外白油样品GW2。通过白油样品杂质含量数据分析结合免疫效果，不难看出影响注射用矿物白油佐剂免疫效果的主要因素是杂质含量。

按照文献“馏分主要集中在C16～C20之间的抗体效价最高而且副作用比较小［2］”的报道，白油样品正碳数在C16～C20分布比例差异较大：国外白油样品GW2比例最高为29.54%，其次是国外白油样品GW1为7.74%，最低的是国内白油样品GN1为3.63%，其他国内白油样品在5.50%左右。试验表明免疫效果较好的是试制白油样品JH2，而国外白油样品GW2免疫效果与文献报道并不相符，有待进一步研究分析。

白油的运动黏度与密度直接相关，主要是由链烷烃含量、环烷烃含量、碳数分布情况及其分子量大小决定的。2010年版《兽药典》修订的注射用白油运动黏度为7～13 mm2／s，目前很多兽用灭活疫苗生产厂家普遍使用的白油运动黏度为4～7 mm2／s。试验分析国内白油样品GN1运动黏度较高为7.31 mm2／s，制备的灭活疫苗的黏度相对大些，免疫注射困难、吸收降解慢，残留量多些；而国外白油样品GW2的运动黏度较小为4.38 mm2／s，制备的灭活疫苗的黏度相对小些，免疫注射好，但应激性大，残留量大，抗体消长起伏波动大，因而运动黏度也是影响白油免疫效果的一个因素。参照“疫苗中白油佐剂对鸡群影响较小，增重高于其他各组，疫苗吸收速度快，注射省力，抗体水平优秀，确定为最佳白油佐剂［8］”的标准，试验制备的白油样品JH2免疫效果较好，其运动黏度、烃类组成与含量、碳数分布等参数具有一定参考作用。

注射白油和油乳剂疫苗均影响了肉鸡血清蛋白和甘油三酯的合成与代谢，同时在一定程度上劣化了鸡肉品质，其作用机理还待进一步研究［8］。如何深入研究矿物白油哪些成份与免疫佐剂效果直接相关，哪些成份与免疫毒副作用直接相关，制备出免疫效果优良，无毒副作用矿物白油佐剂，提高动物安全生产，提高动物性食品安全，是一项重要的研究课题。

［1］何海蓉，姜 平，梅 忠，等.不同来源白油佐剂质量分析及其制备的禽流感疫苗安全性与免疫效力研究［J］.中国家禽，2009， 31（22）： 15-18.

［2］李 芳，张 荣，单 虎，等.油佐剂研究进展与质量监控［J］.中国动物检疫，2010，27（12）：70-71.

［3］Fukanoki S，Matsumoto K，Mori H，et al.Effect of liquid paraffin on antibody responses and local adverse reactions of bivalent oil adjuvanted vaccines containing newcastledisease virusand infectious bronchitis virus［J］.J Vet Med Sci， 2000， 62（12）：1317-1319.

［4］中国兽药典委员会.中华人民共和国兽药典三部［S］.北京：中国农业出版社，2010：51-53.

［5］中华人民共和国农业部.中华人民共和国兽用生物制品规程［M］.北京：化学工业出版社，2000：83-85.

［6］王振辉，慈洪波，武桂梅，等.不同来源注射用白油佐剂佐剂免疫效果分析［J］.中国家禽， 2013，35（19）： 48-50.

［7］陈世豪，郝同杨，施祖灏，等.油乳佐剂及其安全性研究进展［J］.中国家禽，2013，35（16）：44-46.

［8］丛秋实，胡瑞鸿，郑德富，等.禽流感（H9）灭活疫苗白油佐剂的优选试验［J］.中国动物保健， 2013，15（10）： 17-19.

［9］陈世豪，施祖灏，郝同杨，等.白油佐剂对肉鸡血清生化指标及鸡肉品质的影响［J］.中国畜牧杂志，2013，49（23）：76-78.