复方中药合剂对鸡红细胞免疫功能的影响

靳双星，张桂枝

（河南牧业经济学院畜牧工程系，河南 郑州 450011）

动物的红细胞与白细胞一样，具有重要的免疫功能，其基础是红细胞表面具有C3b受体（C3bR）。红细胞可通过其表面的C3bR，发挥清除免疫复合物（IC）、促进吞噬、提呈抗原及激活补体等多种作用[1]。研究表明，许多中草药可增强红细胞免疫吸附能力，减少异物对机体的危害[2-8]。前期研究表明，自拟的复方中药合剂能促进免疫器官的发育，增强疫苗的免疫效果，提高热应激下肉仔鸡的生长性能，增强机体清除自由基的能力，提高机体抗氧化水平。本试验旨在探讨饮水中添加复方中药合剂，对肉仔鸡红细胞免疫功能的影响，为该制剂的临床推广应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验样品 复方中药合剂由连翘、黄芪、板蓝根、茯苓、白术、枳实、山楂、甘草8味中药组成。连翘采用醇提法提取连翘提取物；白术、枳实采用蒸馏法提取挥发油，滤液与黄芪、茯苓、甘草、山楂、板蓝根混合水煎2次，合并上述滤液浓缩至比重1.10（温度60℃）、加入乙醇使其沉淀，滤过；滤液与连翘提取物混合，加入白术、枳实挥发油及吐温-80，加入30%蔗糖，调节药物浓度至1∶1，并调节pH值至中性，灭菌备用。

1.2 材料与试剂 离心机、恒温水浴箱、显微镜、计数器、小离心管、血细胞计数管。酵母试剂、Hank′s液、家兔血清、瑞氏-姬姆萨染液等。

1.3 试验动物与设计 1日龄健康AA肉仔鸡，隔离饲养至7日龄，选取120只体重相近健康的肉仔鸡（雌雄各半），随机分为3组，每组4个重复，每个重复10只鸡，分笼饲养。A组作为空白对照组，不进行新城疫活疫苗免疫；B、C两组均在7日龄2倍量点眼滴鼻接种新城疫活疫苗LaSota株，B组正常饮水，C组接种疫苗的同时在饮水中添加1.0%复方中药合剂，连续用药7 d。在14、21、28日龄和35日龄时，每个重复随机抽取2只鸡，每组8只鸡，心脏采集血液，1%肝素抗凝，待检。

1.4 红细胞C3b受体（RBC-C3bR）花环率检测

1.4.1 C3b致敏酵母悬液制备 将酵母试剂用Hank′s液（pH值7.2）洗1次（1 000 r/min离心10 min），配成含酵母细胞1.0×108/mL的悬液，加等量新鲜家兔血清，混匀，37℃水浴20 min。然后再以Hank′s液洗2次，恢复原浓度，即为C3b致敏酵母细胞悬液。

1.4.2 红细胞悬液制备 分别将上述各时间采集的肝素抗凝血2 000 r/min离心10 min，吸出上清液 (血浆 )，用Hank′s液洗3次（每次以2 000 r/min离心5 min），最后将红细胞用Hank′s液稀释成1.25×107细胞/mL的悬液。

1.4.3 检测方法 取C3b致敏酵母悬液和红细胞悬液各50 μL，混匀，于37℃水浴40 min后取出，轻轻摇起，加0.25%戊二醛溶液20 μL固定5 min，用适量Hank′s液稀释，涂片，干燥，甲醇固定，用瑞氏-姬姆萨染液染色，高倍镜检查。以1个红细胞粘附2个或2个以上酵母细胞为1个花环，计数200个红细胞，计算出花环率：RBC-C3bR花环率=RBC-C3bR花环数/200×100%。

1.5 红细胞免疫复合物(RBC-IC)花环率检测 除酵母细胞不致敏外，其余同RBC-C3bR花环率检测。

1.6 统计分析 试验数据采用SPSS 12.0中One-Way ANOVA过程进行单因素方差分析，并进行Duncan′s多重比较，以P＜0.05作为差异显著性判断标准，结果以平均值±标准差表示。

2 结果与分析

2.1 复方中药合剂对肉仔鸡RBC-C3bR花环率的影响 由表1结果可知 ，A、B、C组之间，RBC-C3bR花环率的形成明显不同。免疫后第7天（即14日龄），C组高于空白对照A组，但无显著性差异（P＞0.05）；B组显著低于A组（P＜0.05）；C组极显著高于B组（P＜0.01）。免疫后第14天（即21日龄），B组高于A组，但无显著性差异（P＞0.05）；C组极显著高于A、B组（P＜0.01）。免疫后第21天（即28日龄），B组显著高于A组（P＜0.05），C组极显著高于A、B组（P＜0.01）。免疫后第28天（即35日龄），C组极显著高于A组（P＜0.01），显著高于B组（P＜0.05）。

表1 复方中药合剂对肉仔鸡RBC-C3bR花环率的影响

2.2 复方中药合剂对肉仔鸡RBC-IC花环率的影响 由表2结果可知 ，A、B、C组之间，RBC-IC花环率的形成明显不同。免疫后第7天（即14日龄），C组显著高于A组（P＜0.05），极显著高于B组（P＜0.01）；B组显著低于A组（P＜0.05）。免疫后第14天（即21日龄），C组极显著高于A、B组（P＜0.01），A组与B组之间无显著性差异（P＞0.05）。免疫后第21天（即28日龄），C组极显著高于 A、B组（P＜0.01），B组显著高于 A组（P＜0.05）。免疫后第28天（即35日龄），C组极显著高于A组（P＜0.01），显著高于B组（P＜0.05）。

3 讨论

表2 复方中药合剂对肉仔鸡RBC-IC花环率的影响

红细胞膜上已明确的补体受体有I型补体受体（CR1）和Ⅲ型补体受体（CR3）。CR1由 Fearon于1979年首次分离，是红细胞免疫的重要基础。目前认为，绝大多数C3b免疫复合物(C3b-IC)可与CR1连接。CR1广泛存在于红细胞、多形核白细胞、巨噬细胞以及T、B淋巴细胞膜的表面。不同细胞所含CR1数量不同[9]，其中红细胞为950个，B细胞为2 100个，多形核白细胞为57 000个，单核细胞为48 000个。尽管单个白细胞表面CR1较红细胞多，但由于血液中红细胞总数远远超过白细胞总数，并且循环系统中约95%的C3b受体位于红细胞膜上，所以红细胞与循环免疫复合物结合的机率是白细胞的500～l 000倍。因此，体内对免疫复合物的清除起主要作用的是红细胞而不是白细胞[1，9-10]。

红细胞粘附的免疫复合物随血流被带到固定吞噬系统(如肝、脾)。固定吞噬系统捕获红细胞结合的免疫复合物后，通过巨噬细胞膜表面的Fc受体与免疫复合物中Fc段结合。此时，红细胞从免疫复合物上解离，再度进入循环，而捕获了免疫复合物的巨噬细胞则通过膜表面的CR1受体再与免疫复合物的补体C3b结合，Fc受体与CR1受体的协同作用使巨噬细胞的吞噬作用加强，将免疫复合物吞噬，并清除出体内。

红细胞的粘附活性可作为评价红细胞免疫功能的重要指标。郭峰等建立了简易的红细胞C3b受体酵母花环试验与红细胞免疫复合物酵母花环试验，用于测定RBC-C3bR花环率和RBC-IC花环率。RBC-C3bR花环率和RBC-IC花环率高低可作为红细胞免疫粘附功能的指标。

本试验研究结果表明，健康鸡经新城疫活疫苗免疫后，RBC-C3bR花环率和RBC-IC花环率与空白对照组相比短暂显著降低，说明用新城疫活疫苗免疫会引起机体红细胞免疫功能短暂性下降，与乔海博等试验结果一致[11]，这可能是新城疫活疫苗毒株进入机体后破坏血液中红细胞膜上的C3b受体所致。红细胞C3b受体分子是分子量约为200 000的糖蛋白，极易受到各种抗原的危害。饮水中添加复方中药合剂，在不同日龄均能不同程度提高RBC-C3bR花环率和RBC-IC花环率，与疫苗对照组相比存在显著或极显著差异（P＜0.05或P＜0.01）。说明复方中药合剂能显著提高红细胞的免疫功能，并能克服因接种疫苗引起红细胞免疫功能短暂下降的不良反应。

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