赤芍、白芍煎剂对金黄色葡萄球菌诱导肺炎小鼠血清HMGB1水平影响的比较

陈 瑶，马 倩，张 莉，王渠源，李璐璐，聂 奎

（西南大学动物科技学院，重庆400715）

近年来，研究发现高迁移率族蛋白（High Mobility Group Protein，HMG）家族成员的HMGB1是一种重要的晚期炎症介质，参与了多种疾病的发生发展，在内毒素的致病过程和脓毒症中水平增高［1］。赤芍和白芍作为两种传统中药材，赤芍具有清热凉血，散瘀止痛功效，医学临床主要用于改善心血管系统、抗炎、抗肿瘤、抗氧化等［2］；而白芍有养血调经，平肝止痛，敛阴止汗的作用，临床上用于抗炎、解痉、镇痛、护肝等［3］。鉴于赤芍、白芍都具有一定的抗炎功效，因此，采用炎症介质HMGB1水平的变化来比较两种芍药的抗炎作用，这对治疗脓毒症等晚期炎症的中药研究，尤其是为含赤芍、白芍的中药方剂的拆方研究奠定一定的药理基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物 昆明种健康小鼠70只，体重18～22 g，雌雄各半，购自重庆市中药研究院，批号：SCXK（渝）2012-0006。小鼠饲养于西南大学动物医院动物房，分组后分笼饲养。

1.1.2 试剂 赤芍、白芍购自重庆中药材市场。金黄色葡萄球菌标准菌株由重庆市动物疫病预防控制中心提供。地塞米松，西南药业股份有限公司，批号：120105。小鼠HMGB-1 ELISA试剂盒，美国Promega公司。

1.1.3 仪器 旋转蒸发器，上海亚荣生化仪器厂；切片机，德国Leica公司；ELX405TM洗板机，美国Biotek公司；Thermo酶标仪，美国Thermo fisher公司。

1.2 方法

1.2.1 赤芍、白芍煎剂制备 参照杨琪伟等［4］的方法，用水提醇沉法制备赤芍、白芍煎剂，使每毫升含生药1 g，灭菌后放入4℃冰箱冷藏保存。

1.2.2 小鼠肺炎模型建立 将金黄色葡萄球菌增菌培养，调整菌液浓度至1×109CFU／mL，参照刘颖等［5］的方法，用乙醚将小鼠麻醉，取金黄色葡萄球菌菌液对小鼠滴鼻感染（50 μL／只），建立金黄色葡萄球菌小鼠吸入性肺炎模型。

1.2.3 试验分组及给药 按随机数字法随机将70只小鼠随机分为5组：空白对照组、肺炎模型组、赤芍处理组、白芍处理组和地塞米松处理组。每组14只。金黄色葡萄球菌小鼠吸入性肺炎模型建立1 h后按组别进行药物处理，空白对照组、肺炎模型组小鼠给予生理盐水。各组均灌胃给药，剂量均为0.01 mL／g。之后每12 h给药一次，共6次。

1.2.4 血液样本采集 分别于金黄色葡萄球菌感染小鼠后 18、36、48、60、72 h每组随机选择小鼠 5只，采集小鼠尾部血液，将采集的血液离心得血清，分装标记后置-20℃保存备检。

1.2.5 石蜡切片制作 在72 h血液采集完成后处死小鼠，开胸摘取小鼠肺组织并投入固定液，按常规组织切片方法［6］：取材固定、脱水透明、浸蜡包埋、切片贴片、HE染色、脱水透明、封片，并进行镜下观察。

1.2.6 HMGB1检测 用ELISA法检测小鼠血清中HMGB1水平，按试剂盒所附的说明书进行操作。

2 结果

2.1 小鼠肺炎模型建立 感染小鼠12 h后，随机解剖感染后的小鼠和未经处理的小鼠各3只。经观察，感染小鼠肺组织均充血、肿大；未处理的小鼠肺组织均正常。金黄色葡萄球菌小鼠吸入性肺炎模型建立成功。

2.2 HMGB1含量变化 肺炎模型组小鼠与空白对照组小鼠相比，肺炎模型组小鼠HMGB1浓度值于感染小鼠后 18、36、48、60、72 h 均高于空白对照组，差异极显著（P＜0.01）。赤芍处理组、白芍处理组、地塞米松处理组小鼠与肺炎模型组小鼠相比，赤芍处理组HMGB1浓度值于感染金黄色葡萄球菌后36 h时显著低于肺炎模型组，于48、60、72 h时极显著低于肺炎模型组；白芍处理组HMGB1浓度值于48、60、72 h极显著低于肺炎模型组；地塞米松处理组HMGB1浓度值分别于48、60、72 h极显著低于肺炎模型组。白芍处理组、赤芍处理组与地塞米松处理组相比，白芍处理组于18、60 h时显著、极显著低于地塞米松处理组；赤芍处理组与地塞米松处理组无显著差异。白芍处理组与赤芍处理组相比，白芍处理组于48、60 h时极显著低于赤芍处理组，72 h时显著低于赤芍处理组（表1）。

2.3 肺组织病理变化 感染小鼠后72 h小鼠肺组织切片中，空白对照组肺组织正常，肺泡结构完整。肺炎模型组肺泡壁显著增厚，肺支气管周围炎性细胞浸润，管腔充血。白芍处理组肺组织结构较完整，部分肺泡壁增厚，肺泡腔内无异物。赤芍处理组肺组织结构较完整，仅少许肺泡腔充血。地米处理组肺组织结构完整，部分肺泡壁增厚，少许肺泡腔充血（图1）。

表1 赤芍、白芍煎剂对金葡菌诱导肺炎小鼠血清HMGB1水平影响的比较 （x ±s）

图1 赤芍、白芍干预下72 h小鼠肺组织切片（HE 200×）

3 讨论

1999 年，Wang等［7］发现 HMGB1 可以释放到胞外并介导炎症反应，为内毒素血症和脓毒症的重要炎症介质，并第一次把HMGB1认定为一种炎症晚期调节因子。研究已证明，巨噬细胞、单核细胞、中性粒细胞和坏死细胞在细菌、LPS、TNF-α、IL-1刺激下均可释放HMGB1至胞外，释放到胞外的HMGB1能再次激活单核细胞、巨噬细胞、内皮细胞和中性粒细胞，诱发IL-1、IL-8、TNF-α等多种炎症介质释放，而炎症介质又促进HMGB1的分泌，使炎症反应不断放大、加重。HMGB1在炎症因子网络中起着重要作用，在多种感染性疾病中均扮演着重要角色。

芍药是我国传统中药材，有赤芍、白芍之分；赤芍为毛茛科植物芍药或川赤芍，所直接使用的干燥根，而白芍为植物芍药水煮去皮后使用的干燥根［8］。现代医学研究表明，赤芍和白芍都具有改善血液流变学状态，调节机体微循环，抑制血小板聚集及机体内、外源性凝血，保护肝损伤组织等作用，中医临床上也多用于抗炎。之前，对赤芍、白芍抗炎的研究多集中 NF-κB、TNF-α、IL-6、IL-10、MCP-1等炎症介质［9-11］，却未见有在炎症反应过程中是否能对炎症介质HMGB1水平产生影响的相关研究资料。本次试验结果显示，赤芍、白芍均能显著降低肺炎小鼠血清中HMGB1的水平，并明显减轻肺组织损伤程度，这提示两种药物具有减轻炎症反应的作用，但相对而言，白芍的抗炎效果优于赤芍。但在现代中药药理的试验研究中，多都以芍药苷作为研究对象。项亚西等［12］研究表明：赤芍的芍药苷含量达3.5%～7.98%，而白芍的芍药苷含量仅为1.86%～5.76%［12］，二者的芍药苷含量存在有明显差异，故单从芍药苷这一角度无法真正表明二者的药理学作用。赤芍、白芍都含有芍药苷、羟基芍药苷，芍药内酯苷，苯甲酰羟基芍药苷。但是，除赤芍的芍药苷含量明显高于同基源的白芍外，含量差别较大的化学成分还有芍药内酯苷和儿茶素等［13］，白芍的芍药内酯苷含量均值是赤芍样品含量均值的6倍以上［14］，这是否说明芍药内酯苷是芍药中发挥抗炎作用的主要成分之一，值得进一步深入研究。

［1］Yang H， Wang H， Tracey K J.HMGB1 rediscovered as a cytokine［J］.Shock， 2001， 15（4）： 247-257.

［2］冀兰鑫，黄 浩，李长志，等.赤芍药理作用的研究进展［J］.药物评价研究，2010，33（3）：233-236.

［3］项亚西，张京红.赤白芍化学成分和药理作用的差异［J］.海峡药学，2010，22（11）：43-44.

［4］杨琪伟，杨 莉，熊爱珍，等.赤芍和白芍抗炎作用的UPLCMS代谢组学初步研究［J］.中国中药杂志，2011，36（6）：694-697.

［5］刘 颖，时宇静，时 瀚，等.银翘解毒软胶囊对流感病毒感染小鼠肺炎模型肺组织病毒载量及M1蛋白表达的影响［J］.药学学报，2011，46（6）：650 655.

［6］滕可导.彩图家畜组织学与胚胎学实验指导［M］.北京：中国农业大学出版社，2008.

［7］Wang H，Bloom O，Zhang M，et al.HMG-B1 as a late mediator of endotoxin lethality in mice［J］.Science， 1999， 285（5425）：248-251.

［8］国家药典委员会.中华人民共和国药典二○一○年版［S］.

［9］魏 晓.赤芍煎剂治疗重症胰腺炎及对大鼠体内炎症介质的影响［D］.第二军医大学，2007.

［10］朱慧民，牟华明.赤芍对球囊损伤术后血管内膜单核细胞趋化蛋白-1基因表达的影响［J］.中国中西医结合急救杂志，2008， 15（3）： 138-141.

［11］李志军，刘 雁，梅永君，等.白芍总苷治疗强直性脊柱炎的疗效及其机制探讨［J］.中药药理与临床，2009，25（3）：68-70.

［12］项亚西，张京红.赤白芍化学成分和药理作用的差异［J］.海峡药学，2010，22（11）：43-44.

［13］周红涛，骆亦奇，胡世林，等.赤芍与白芍的化学成分含量比较研究［J］.中国药学杂志， 2003， 38（9）： 654-656.

［14］吴金雄.白芍、赤芍化学成分与活血功效的比较研究［D］.广州中医药大学，2012.