三种中药提取物体外抗猪繁殖与呼吸综合征病毒的作用

陈志胜，王丙云，冼琼珍，陈胜锋，计慧琴，何永明

（佛山科学技术学院动物医学系，广东佛山528231）

从中药中提取、分离有效成分，并采用分子生物学研究手段来研究其药物分子结构与抗病毒分子机理间的关系，寻找出有效的抗病毒药物是一个研究热点。抗病毒中药中主要的有效成分有多糖类、皂苷类、黄酮类和生物碱类等［1-3］。在本研究室前期工作中筛选到了多种对PRRSV有效的抗病毒中药［4-5］，现拟对其中三种中药的活性成分的抗病毒作用做进一步的研究，其中穿心莲内酯是中药穿心莲的主要成分之一，是二萜内酯类化合物，具有解热、抗炎、抗菌、抗病毒等功效［6］。芦根多糖具有很强的抗氧化活性，可以清除生物体内自由基，同时具有调节免疫、抗病毒作用［7］。夏枯草多糖有抗氧化、抗病毒、抗肿瘤等生物活性［8］。研究考察这些中药有效成分体外抗PRRSV药效以及细胞毒性，为进一步阐明其作用机制以便更好地为兽医临床提供有效的科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料 Marc-145细胞由华南农业大学兽医微生物学与免疫学实验室惠赠，以DMEM（Hyclone）添加10%胎牛血清（Hyclone）以及双抗（青、链霉素终含量均为100 IU／mL）完全培养液培养单层备用；PRRSV经典毒株由华南农业大学兽医学院惠赠，采用 Reed-Muench两氏法测定 PRRSV对Marc-145的半数感染剂量（TCID50）为 10-5／mL。

1.2 中药提取液的制备 穿心莲内酯盐由广东药学院中药学院438实验室提供，为穿心莲内酯的亚硫酸氢钠加成物，初始液浓度为5.0 mg／mL。采用酶法从芦根中提取芦根多糖，参考李粉玲等［9］的方法，以纤维素酶分解芦根，并通过醇提、浓缩和纯化后制得高浓度芦根多糖液，分光光度法测得原液浓度为36.8 mg／mL。夏枯草多糖的提取参照文献方法［10］，分光光度法测得原液浓度为 18.0 mg／mL。

1.5 数据处理及药物评价 用SPSS19.0软件进行统计分析，先计算提取物不同浓度下的平均OD值（以±S.E表示），依此根据公式计算对细胞的抑制率或保护率，最后以药液对细胞保护率来评价中药提取物的效果，细胞保护率越大则说明药物抗PRRSV作用越强。

2 结果

2.1 中药提取物对Marc-145细胞的安全浓度细胞病变效应作用（CPE）观察结果表明，三种中药提取物对Marc-145细胞都有一定的毒性作用，主要表现为细胞折光性增加、粘连、变圆、破碎、脱落。药液浓度越高，对细胞毒性越大，存活细胞越少，其MTT法检测的OD值也越小，符合中药浓度过高导致毒副作用的规律。结合CPE观察结果，根据公式计算不同浓度芦根多糖对细胞的生长抑制率，当生长抑制率为0则表明该浓度下提取物对细胞无毒性作用，从而确定药物最大安全浓度（表1）。结果显示，穿心莲内酯盐对细胞的最大安全浓度为0.156 mg／mL，芦根多糖为 0.575 mg／mL，夏枯草多糖为 1.125 mg／mL。

表1 中药提取物对Marc-145细胞的生长抑制率及安全浓度

2.2 中药提取物抗PRRSV的药效 穿心莲内酯盐对PRRSV感染时在阻断作用方式中，浓度高于0.08 mg／mL时，反而没有阻断作用，随着浓度的降低，保护率越来越强；抑制作用方式中，从0.04～0.16 mg／mL下，抑制作用强，保护率均为100%。浓度低于0.02 mg／mL则抑制作用明显下降；而杀灭作用方式中，从0.02～0.16 mg／mL下，都有杀灭作用，保护率均为100%。

芦根多糖抗PRRSV感染的试验显示，在最高浓度0.575mg／mL时能阻断PRRSV吸附，100%保护细胞，浓度下降保护率随之下降。在0.575～0.144 mg／mL浓度下显著抑制PRRSV的增殖。直接杀灭作用很强，在最小实验浓度0.072 mg／mL下对细胞保护率仍达100%。总体来说，芦根多糖对PRRSV的直接杀灭作用大大强于阻断作用。

夏枯草多糖对PRRSV的阻断作用不强但可显著抑制PRRSV的增殖，在合适浓度下对PRRSV也有杀灭作用。和穿心莲内酯盐一样其阻断作用在高浓度下不起作用，浓度降至0.141 mg／mL时开始具有一定作用。而所检测的四个浓度范围都可有效抑制PRRSV的增殖，保护率达100%。杀灭效果中两个高浓度组都可达到100%保护效果，随着浓度下降保护作用降低。

表2 不同浓度的中药提取物体外抗PRRSV作用的细胞保护率 %

3 讨论

3.1 中药提取物对细胞生长的安全浓度 穿心莲内酯盐、芦根多糖和夏枯草多糖对Marc-145细胞安全浓度分别为0.156、0.575和1.125 mg／mL，对比冼琼珍对中药整体试验得到的安全浓度为6.25、12.5 和 1.56 mg／mL 可以看出［4］，穿心莲内酯盐和芦根多糖对细胞的安全浓度显著下降达20倍以上，说明这两种中药提取物成分可能分别是这两种中药的主要引起细胞生长抑制的物质，对安全使用这两种中药起到主要限制作用。而夏枯草多糖和夏枯草整体对细胞的安全浓度差别不大［4］，说明这种中药的多糖成分对细胞生长抑制很小，可以安全使用。

3.2 中药提取物抗病毒作用 与冼琼珍用中药整体试验结果比较［4］，中药提取物对PRRSV的阻断作用和抑制作用上两者非常相似，三种中药及其提取物对病毒的增殖都有明显的抑制作用，可以保护感染了病毒的细胞，使其正常生长；而在阻断病毒粘附上除了芦根和芦根多糖在最高安全浓度组有作用外，其他都没有明显效果。说明在抑制作用和阻断作用两种抗病毒方式上，三种提取物分别是这三种中药抗病毒的组成成分。在病毒的杀灭作用上，三种中药提取物明显比中药整体药效增强，说明这些提取物为杀灭病毒的药效成分，并且在无其他中药成分干扰情况下直接杀灭病毒的作用增强。

从三种中药提取物抗病毒的作用方式来看，对病毒的抑制和杀灭作用要大于阻断作用，这提示在使用这些中药提取物时的剂型和吸收方式应该适应于药物的作用方式。试验结果表明穿心莲内酯盐、芦根多糖和夏枯草多糖均有抗病毒作用，尤其是具有一定的杀灭病毒的作用，说明这三种成分为抗病毒中药的主要药效成分。

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