甜地丁中槲皮素的薄层鉴别和含量测定

杨修镇

（山东省兽药质量检验所，济南250022）

甜地丁为豆科植物米口袋Gueldenstaedtia verna（Georgi）A.Bor.的干燥全草，收载于《中华人民共和国兽药典》二○一○年版二部，具有清热解毒的功效［1］，临床用于痈肿疔疮，外耳道疖肿，阑尾炎的治疗。甜地丁是兽用常用中药材之一，原标准无薄层鉴别项和含量测定项，为了更好的控制本品质量，本实验对甜地丁中槲皮素的薄层鉴别和含量测定方法进行了研究。

1 材料与方法

1.1 仪器和材料 Agilent 1200高效液相色谱仪，槲皮素对照品，批号100081-200907，含量为96.5%，购自中国食品药品检定研究院。甜地丁饮片，批号20120411、20120523、20120618、20120622 购自涑玉平民大药房，批号 20130311、20130415、20130518、20130524、20130617购自济南建联中药店，批号20130722由山东中医药大学药学院提供。10批甜地丁饮片经山东中医药大学药学院生药系中药鉴定专家李峰教授鉴定为豆科植物米口袋Gueldenstaedtia verna（Georgi）A.Bor.。硅胶G薄层板分别购自烟台化学工业研究所、青岛海洋化工分厂、德国Merck公司。甲醇为色谱纯，流动相用水为超纯水，其余试剂均为分析纯。

1.2 定性鉴别

1.2.1 对照品溶液制备 称取槲皮素对照品1 mg加甲醇2 mL溶解，即得。

1.2.2 供试品溶液制备 取甜地丁饮片，粉碎，过三号筛，称取2 g，加70%乙醇20 mL，加热回流1 h，滤过，滤液蒸干，残渣加稀盐酸10 mL使溶解，加热回流30 min，放冷，用乙醚振摇提取3次，每次10 mL，合并乙醚液，蒸干，残渣加甲醇1 mL使溶解，即得。

1.2.3 薄层色谱方法 吸取槲皮素对照品溶液和供试品溶液各2 μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以甲苯-乙酸乙酯-甲酸（7 ∶5 ∶0.5）［2］为展开剂，展开，取出，晾干，喷以3%三氯化铝乙醇溶液，置紫外灯（365 nm）下检视。

1.3 含量测定

1.3.1 高效液相色谱条件［3］色谱柱为C18（4.6 mm×250 mm，5 μm），流动相为甲醇-0.3%磷酸溶液（50 ∶50），检测波长为360 nm，流速1.0 mL／min，柱温25℃，进样量 10 μL。

1.3.2 对照品溶液制备 精密称取槲皮素对照品10 mg置100 mL量瓶中，加80%甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得100 μg／mL的槲皮素对照品贮备液。精密量取上述槲皮素对照品贮备液5 mL，置25 mL量瓶中，用80%甲醇稀释至刻度，摇匀，即得20 μg／mL的槲皮素对照品溶液。

1.3.3 供试品溶液制备［4］取甜地丁饮片，粉碎，过三号筛，精密称取2 g，置具筛锥形瓶中，精密加入80%甲醇50 mL，称定重量，加热回流2 h，再称定重量，用80%甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液20 mL，精密加入25%盐酸7 mL，置85℃ 水浴中水解30 min，取出，迅速放冷，转移至50 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得。

1.3.4 线性范围考察［5］精密量取槲皮素对照品贮备液，用 80%甲醇稀释成 5、10、20、40、80、100 μg／mL的系列溶液，注入液相色谱仪，在上述高效液相色谱条件下进行测定，以峰面积（y）为纵坐标，浓度为横坐标（x，μg／mL），进行线性回归分析。

1.3.5 精密度试验

1.3.5.1 仪器精密度试验 精密吸取20 μg／mL的槲皮素对照品溶液10 μL，注入液相色谱仪，连续进样6次，在上述高效液相色谱条件下进行测定。

1.3.5.2 重复性试验 取同批甜地丁药材粉末（过三号筛）约2 g，精密称定，按1.3.3项下制备样品溶液，制备6份，在上述高效液相色谱条件下分别进行测定。

1.3.6 回收率试验 精密称取已知槲皮素含量的甜地丁饮片粉末（过三号筛）1 g，精密加入浓度为20 μg／mL 的槲皮素80%甲醇溶液 50 mL，自“称定重量，加热回流2 h”起按供试品溶液制备项制备样品溶液，平行6份，注入液相色谱仪，在上述高效液相色谱条件下分别进行测定。

1.3.7 耐用性

1.3.7.1 供试品溶液的稳定性 取同一供试品溶液，于制备后 0、1、2、4、8、16、24、48 h 注入液相色谱仪，在上述高效液相色谱条件下分别进行测定。

1.3.7.2 色谱条件的微小变动 取同一供试品溶液，将流动相调整为甲醇-0.3%磷酸溶液（48 ∶52）、（52 ∶48）；柱温的调整为22、28 ℃；流速调整为0.9、1.1 mL／min；检测波长调整为358、362 nm，并更换不同厂家的同类型色谱柱分别进行测定。

1.3.7.3 供试品溶液制备条件的微小变动 取同一批甜地丁饮片，将加热回流时间调整为110、130 min，水解时间调整为 25、30 min，其余按供试品溶液制备项制备样品溶液，注入液相色谱仪，在上述高效液相色谱条件下分别进行测定。

1.3.8 10 批样品含量测定 取不同批号的甜地丁药材，按1.3.3项下制备样品溶液，注入液相色谱仪，在上述高效液相色谱条件下分别进行测定。

2 结果

2.1 定性鉴别 供试品色谱中，在对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点，可实现有效分离，见图1。

图1 甜地丁中槲皮素的薄层鉴别照片

2.2 含量测定

2.2.1 色谱分离 在上述高效液相色谱条件下，分析得到对照品溶液、供试品溶液的色谱图，从图2、图3可知，在所采用的色谱条件下，槲皮素可以得到很好的分离。

图2 槲皮素对照品HPLC色谱图

2.2.6 10批样品含量测定 10批甜地丁饮片中槲皮素含量在0.51～1.23 mg／g之间，不同饮片含量差异较大。结果见表2。

图3 甜地丁样品HPLC图谱

2.2.2 线性范围考察 回归方程为：y＝ 18.7190x+2.4276（r＝ 0.9997） 。 结果表明槲皮素进样浓度在5～100 μg／mL的范围内与峰面积呈良好的线性关系。

2.2.3 精密度试验

2.2.3.1 仪器精密度试验 重复测定同一对照品溶液6次，峰面积RSD为0.3%，表明有仪器有良好的精密度。

2.2.3.2 重复性试验 重复测定同一批甜地丁饮片6次，槲皮素含量 RSD为0.6%，表明重复性好。

2.2.4 回收率试验 槲皮素平均回收率为96.1%，RSD为0.7%，结果见表1。

表1 回收率试验

2.2.5 耐用性

2.2.5.1 供试品溶液的稳定性 同一供试品溶液，于制备后 0、1、2、4、8、16、24、48 h 测定结果 RSD 为0.4%，表明样品溶液在48 h内稳定。

2.2.5.2 色谱条件的微小变动 动相组成的微小波动：甲醇-0.3%磷酸溶液（48 ∶52）和（52 ∶48）；柱温的微小变动（22、28℃）；流速的微小变动（0.9、1.1 mL／min）；检测波长的微小变动（358、362 nm）以及采用不同厂家的同类型色谱柱对供试品溶液槲皮素的分离效果无明显影响。

2.2.5.3 供试品溶液制备条件的微小变动 加热回流时间的微小变动（110、130 min），水解时间的微小变动（25、30 min），同批甜地丁饮片槲皮素含量结果相对相差在1.5%以内。

表2 10批样品含量测定结果

3 讨论与小结

本研究中采用3个厂家生产的硅胶G薄层板对薄层鉴别效果进行了比较，结果表明槲皮素均分离良好。但槲皮素专属性较差，含有槲皮素的药材种类较多，如能加快甜地丁对照药材的研制，采用对照药材进行鉴别则能更好的控制药材质量。

本研究中供试品溶液制备项对甜地丁饮片的回流时间进行了考察，发现回流时间为1 h，所测槲皮素含量值偏低，而回流时间为2 h和3 h则无明显差异，故回流时间定为2 h。同时对精密加入25%盐酸7 mL，置85℃ 水浴中水解的时间进行了考察，发现水解时间为10 min，所测槲皮素含量值偏低，而水解时间为30 min和60 min则无明显差异，故水解时间定为30 min。

目前尚无甜地丁中槲皮素含量测定的报道。本研究中所用的甜地丁饮片大多购自药店，少量为大学学院提供，饮片受炮制加工、存储等因素影响较大，要制订含量限度尚需进行大量研究。

［1］中国兽药典委员会.中华人民共和国兽药典二○一○年版二部［S］.

［2］王晓飞，于 玲，杜华霜，等.三白草中槲皮素的薄层色谱鉴别［J］.中国民族民间医药，2013，23（1）： 65-68.

［3］王 信.HPLC法测定虎杖叶中槲皮素的含量［J］.中药材，2006，04（1）： 96-97.

［4］王祥培，许士娜，吴红梅，等.天胡荽药材中槲皮素的薄层鉴别与含量测定［J］.时珍国医国药，2010，21（1）： 44-45.

［5］高迎春，杨修镇，魏秀丽，等.地锦草提取物制备工艺及质量控制研究［J］.中国兽药杂志，2010，44（6）： 23-26.