兽用鸡脾转移因子的多肽组成研究

黄迪海，刘 霞，盛晓丹，董玉兰，綦学慧，张从敬，徐秀荣，张再辉，秦卓明，3∗

（1.山东省健牧生物药业有限公司，济南250100；2.济南市动物生物药品工程技术研究中心，济南250100；3.山东省农业科学院家禽研究所，济南250023；4.中国农业大学，北京100094）

兽用鸡脾转移因子（Transfer Factor，TF）是具有免疫活性的T淋巴细胞在抗原或丝裂原的刺激下释放的一类可透析的小分子多肽，具有增强淋巴细胞转化，提高机体免疫功能的作用。TF可将供体的细胞免疫功能特异地转给受体，而且能转移包括真菌、细菌、病毒、寄生虫、组织相容性抗原和肿瘤抗原等多种抗原的细胞免疫，是一种新型免疫制剂［1］。

自20世纪50年代首次发现TF至今，国内外研究人员对其进行了广泛深入的研究和应用，发现TF具有分子质量小、无毒、无抗原性、不引起过敏反应、不产生特异性抗体，且可超越种属界限应用等优点，具有治疗免疫缺陷［2］、恶性肿瘤［3］、感染性疾病［4］等作用。1979年以后，国内外逐渐将TF应用于兽医免疫和临床治疗。2011年，我国批准兽用转移因子口服溶液上市。TF在防治动物传染病［5］、增强机体免疫［6］、提高疫苗效果［7］等方面效果确切，但其多肽组成不明确，在调控肠道粘膜屏障中的作用机理不清楚，严重制约TF的应用。本研究旨在探索鸡脾转移因子的多肽组成，为进一步研究其有效成分和作用机理提供技术支持。

1 材料与方法

1.1 材料 兽用鸡脾转移因子，由山东省健牧生物药业有限公司生产，多肽含量≥1mg／mL，样品生产批号为：20121101、20121102、20121103；绵羊静脉血；新鲜猪胸腺；乙腈、超纯水，色谱纯；TrisHCL、NaCl、KH2PO4等试剂均为分析纯。

1.2 仪器 高速组织捣碎机，质谱仪（LTQVelos），分光光度仪（P-2000），医用低速离心机，恒温水浴锅，显微镜（XSS-2A）。

1.3 方法

1.3.1 多肽含量测定 按照福林酚Lowry法［8］测定兽用鸡脾转移因子样品溶液的多肽含量。

1.3.2 分子量测定 采用MALDI-TOF-MS法，检测条件为固体激光源波长355 nm，离子类型为正离子，检测方式为反射方式（飞行管长2.7 m，加速电压20 kV，反射电压23 kV）和线性方式（飞行管长1.22 m，加速电压kV），基质为CHCA和SA。试验样品溶液ziptip脱盐后MALDI-TOF-MS分析，根据分子量图谱确定样品分子量。

1.3.3 多肽组成分析

1.3.3.1 样品处理 样品用10 kD超滤管离心超滤，通过10 kD超滤管的小肽不用酶解，直接用质谱分析，选择no enzyme。未通过10 kD超滤管的样品，将超滤管反转后离心，取样品约 30 μg，加入 30 μL STD buffer，沸水浴 5 min，冷却至室温；加入 200 μL UA buffer（8 mol／L Urea，150 mmol／L TrisHCl pH8.5）混匀，转入30 kD超滤离心管，离心；加入200μL UA buffer离心，弃滤液。 加入100 μL IAA（50 mmol／L IAA in UA），振荡1 min，避光室温 30 min，离心；加入100 uL UA buffer，离心，重复 2 次；加入 100 μL 25 mol／LNH4HCO3，离心，重复 2 次；加入 40 μL Trypsin buffer （2 μg Trypsin in 40 μL25 mol／L NH4HCO3），振荡1 min ，37 ℃ 16～18 h。 换新收集管，离心，收集滤液，进行质谱分析，选择Trypsin。

1.3.3.2 毛细管高效液相色谱方法 A液为0.1%甲酸的水溶液，B液为0.1%甲酸的乙腈水溶液（乙腈为84%）。色谱柱以95%的A液平衡后，样品由自动进样器上样到Trap柱。0～105 min，B液线性梯度从4% 到50%；105～114 min，B液线性梯度从50%到100%；114～120 min，B液维持在100%。

1.3.3.3 质谱数据采集 多肽和多肽碎片的质量电荷比按照下列方法采集：每次全扫描后采集20个碎片图谱（MS2 scan）。

1.3.3.4 数据分析 原始文件用BIOWORKS软件搜索相应的数据库。查询IPI数据库CHICK（v3.81）分类系统，得到鉴定的蛋白质结果。

1.3.4 活力测定 按照国家卫生部新药转正标准西药第四十七册中脱E受体法［8］，制备脱E受体胸腺T细胞悬液，使最终浓度为每1 mL含3×106～5×106个细胞；制备绵羊红血球悬液，使最终浓度为脱E受体胸腺T细胞悬液浓度的8～10倍；取供试品，用 Hank’s液配制成每1 mL中含1 mg的供试品溶液；取小试管6支，其中3支各加Hank’s液0.1 mL作为对照管，另3支各加供试品溶液0.1 mL作测定管，每管中各加脱E受体胸腺T细胞悬液0.2 mL，37℃保温1 h，加绵羊红血球悬液 0.2 mL，混匀，500 r／min 离心 3 min，4 ℃冰箱过夜；次日取出，弃上清液，每管中各加固定液1滴，轻轻摇匀，静置10 min，加染色液2滴并摇匀，静置15 min后开始计数。显微镜视野中淡蓝色的较大的细胞为淋巴细胞，共数计数板16个大方格上所有淋巴细胞的个数（不少于200个），统计其中的E玫瑰花结形成的细胞数（结合3个以上绵羊红细胞的淋巴细胞），计算结花百分率，取平均值，即为供试品管或对照管的平均数。样品活力＝供试品测定管E玫瑰花结百分率-对照管E玫瑰花结百分率。

2 结果与分析

2.1 多肽含量 用紫外-可见分光光度法，在650 nm波长处测定不同浓度牛血清白蛋白标准品溶液的吸光度，获得标准曲线（见图1），标准方程为：y ＝ 0.0125x+0.0038（R2＝ 0.9986） 。 样品10×6 倍稀释液吸光度检测值分别为0.330、0.332、0.331，带入标准方程，计算，多肽浓度分别为 26.10 μg／mL、26.26 μg／mL、26.18 μg／mL，平均值为 26.18 μg／mL，样品原液多肽含量平均值为1570.8 μg／mL，符合兽用转移因子口服溶液国家标准多肽含量≥1 mg／mL的规定。

图1 标准曲线图

2.2 分子量 反射模式检测多肽分子量范围为800～8000 Da，获得多种小肽，小肽分子量为800.2175～7475.9980 Da，主要集中于800～4000 Da（图2）；线性模式检测分子量范围为4000～20000 Da，获得分子量为6017.6611 Da和8279.9307 Da的两个多肽（图3）。

图2 G1_800_8000_反射模式的分子量图谱

图3 G1_4000_20000_线性模式的分子量图谱

2.3 多肽组成 检测获得多肽共计581种，包括：非酶切方式获得的多肽共512种，主要有T细胞凋亡抑制相关蛋白（TIAL1）、胸腺肽 β4（TMSB4X）、杀菌／通透性增加蛋白（BPIL3）、酶、肌动蛋白、血红蛋白等，具有代表性的多肽（表1）；酶切方式获得的多肽共 69种，主要有抑制因子活化蛋白（RAP1Ab）、抗菌肽（Cathelicidin-2）、细胞色素C（Cytochrome c）等，代表性蛋白见表2。

2.4 活力测定 采用脱E受体法测得，对照管16方格所有淋巴细胞268个，E玫瑰花结细胞31个，结花百分率为11.57%，样品管16方格所有淋巴细胞289个，E玫瑰花结细胞65个，结花百分率为22.49%，样品活力为10.92%（图4）。

表1 非酶切方式获得的具有代表性的多肽

表2 酶切方式获得的具有代表性的多肽

图4 显微镜下E玫瑰花结（A为对照品，B为样品）

3 讨论

3.1 转移因子的多肽组成 转移因子作为一种免疫调节剂广泛应用于人医和兽医领域。国家标准［编号：WS1-（X-451）-2003Z］中规定了其主要成分是多肽和核苷酸。国内众多研究人员对转移因子的氨基酸组成、多肽含量、多肽与核苷酸比例、活性成分混合物等进行了研究。何理平［9］报道，转移因子多肽与小分子RNA的比例为2∶1。范振青等［10］对猪脾转移因子水解后检测，证实其含16种氨基酸，其中以天冬氨酸，谷氨酸和甘氨酸含量较高。刘刚等［11］对转移因子进行氨基酸分析，测得组成多肽的氨基酸占总氨基酸的1／3，游离氨基酸占2／3。凌红丽［12］采用凝胶色谱层析法分离转移因子得到三个洗脱峰并进行活性测定，表明转移因子主要包含三大组分。本试验在验证鸡脾转移因子多肽含量的基础上，利用LC-MS法检测其多肽组成，揭示了鸡脾转移因子含有T细胞凋亡抑制相关蛋白（TIAL1）等581种多肽，并通过查询数据库，获得了对应的蛋白序列，初步阐明了鸡脾转移因子的多肽组成，为国内首次报道。

3.2 转移因子分子量及其分布 转移因子的分子量一般在3000～15000 Da。本试验利用质谱法分析测定鸡脾转移因子分子量分布范围为800 Da～8280 Da，主要为分布于4000 Da以下。虽然利用上述方法测定的分子量都在10000 Da以下，但是在多肽组成测定试验中，仍然分析到了69种分子量大于10000 Da的多肽，具体原因有待进一步研究。

3.3 转移因子功能与组分的关系 转移因子具有增强细胞免疫［13-14］和体液免疫［15］，增强非特异性免疫［16］、抗免疫抑制［17］等作用，但具体是何种成分发挥作用暂无报道。本试验在检测确定鸡脾转移因子生物活性的基础上，对其所含多肽进行分析，证实了转移因子含有与细胞结构和运动相关的肌动蛋白，含有与免疫相关的T细胞凋亡抑制相关蛋白、胸腺肽、抑制因子活化蛋白等，含有与生长发育相关的转录因子蛋白，含有与抗应激相关的热休克蛋白，含有与疫病相关的杀菌／通透性增加蛋白、抑癌蛋白、抗菌肽等。上述蛋白均具有一定的生物学活性，可能与转移因子的功能密切相关。下一步需要通过基因合成和体外表达等方式获得相关多肽蛋白，进一步研究其生物活性，进而验证鸡脾转移因子的有效成分和作用机理。

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