猪SIgA分泌片的分离纯化及其多克隆抗体的制备

2014-11-23崔焕忠马思慧吴天成兰海楠

中国兽药杂志 2014年2期

张辉，崔焕忠，杨欢，马思慧，吴天成，兰海楠，郑鑫

（吉林农业大学动物科技学院，长春130118）

分泌型 IgA（Secretory immunoglobulin A，SIgA）作为粘膜免疫的主要效应因子，在启动免疫学生物活性，清除病原，保护机体抗感染等方面发挥重要作用［1］。SIgA含量高低与机体的粘膜免疫状况以及癌症等疾病密切相关［2-3］，检测SIgA含量不仅可以监测机体粘膜免疫状态，还可有助于疾病诊断。分泌片（secretory component，SC）是构成SIgA分子的组成部分［4］，可以通过检测SC来测定SIgA的含量。SC在初乳中以游离和结合两种存在形式存在［5］，本研究以初乳为材料，分离纯化游离SC，并制备了抗SC的多克隆抗体，为检测SIgA免疫学检测方法的建立奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料 Sephadex G-200凝胶（上海化学试剂厂）；DEAE纤维素（DE52）及透析袋（Whatman公司）；Anti SC McAb（美国 Sigma公司）；蛋白定量试剂盒（北京康为世纪生物科技有限公司）；低分子量蛋白质标准（宝生物大连有限公司）；猪初乳采自长春市某猪场；雄性健康新西兰大耳白兔（长春市生物制品所）。

1.2 试验方法

1.2.1 初乳中SIgA及分泌片的初步提取参照胡正强等方法［6］，取 100 mL 猪初乳，4 ℃ 5000 r／min 离心30 min，吸取脂肪层与沉淀之间的液体约80 mL，加入叠氮钠至终浓度为0.1%，用1 mol／L HCl调pH至4.0，4500 r／min 离心30 min，弃去沉淀，收集上清液，用 2 mol／L Tris 调 pH 至7.3，4500 r／min 离心30 min，将上清液过0.45 μm滤器，获得初乳提取物。

1.2.2 SephadexG-200分子筛凝胶层析法分离初乳提取物称取适量的SephadexG-200，用生理盐水充分膨胀，煮沸，按常规方法装柱，用生理盐水平衡至上样。将初乳提取物用生理盐水透析过夜后，加于柱上，利用自动分步收集器收集洗脱液，每管5 mL，用分光光度计测定洗脱液OD280nm值，根据OD280nm值绘制曲线，分别收集不同洗脱峰，第一峰液体主要为IgG和SIgA的混合物，第二峰液体含有SC［7］。

1.2.3 DEAE 52离子交换层析分离第一峰洗脱液将收集的第一峰洗脱液混合在一起，用50%PEG6000浓缩后，用 0.01 mol／L的 PB 液（pH7.4）4℃平衡过夜，中间更换透析液数次，蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度。将DEAE 52以碱-酸-碱处理活化后，按照常规方法装柱，用0.01 mol／L的PB液（pH7.4）平衡柱子，至流出液体的pH值与流入液体的pH值相等时，开始上样，待样品进入交换剂中，用少量缓冲液冲洗柱壁，然后用0.01 mol／L的PB液（pH7.4）进行洗脱，利用自动分步收集器收集洗脱液，每管5 mL，洗脱蛋白峰为IgG，至无蛋白洗脱下来时，改用0.1 mol／L的PB液（pH6.8）进行洗脱，收集洗脱液，即为纯化的 SIgA［8］。

1.2.4 硫酸铵盐析法分离纯化第二峰洗脱液中的SC将收集的第二峰洗脱液合并到一起，缓慢加入饱和硫酸铵溶液至终浓度为33%，室温下静置1 h，3000 r／min离心 20 min，弃去沉淀（为 IgG），将上清液装入透析袋，用蒸馏水4℃透析，期间更换蒸馏水数次［9-10］。再用PEG6000浓缩，测定其蛋白浓度。

1.2.5 SDS-PAGE分析纯化蛋白的分子量及纯度配制12%的分离胶，将样品与等量的2倍上样缓冲液混匀，煮沸5 min，加样。积层胶电压为80 V，当电泳至浓缩胶和分离胶界面，再升压至120 V，当溴酚蓝距凝胶边缘1 cm处停止电泳，用考马斯亮蓝G250进行染色，观察纯化的SIgA及SC的分子量，利用凝胶薄层扫描分析蛋白纯度。

1.2.6 琼脂双向免疫扩散鉴定纯化蛋白称取一定量的琼脂粉，以1%的比例加入生理盐水，充分融化后倒入平皿中，冷却后打孔，取10 μL Anti SC McAb加入中央孔，外周分别加入分离纯化的SIgA和SC液体［11］，放入湿盒中，置于37℃培养箱中，24 h后观察结果。

1.2.7 抗SC多克隆抗体的制备取1 mg纯化的SC，与等体积的弗氏完全佐剂充分乳化后，背部脊柱两侧、皮下分5点接种兔子，共接种3只；二免，两周后取1.5 mg纯化的SC与等体积弗氏不完全佐剂乳化，以相同的免疫方式接种兔子；三免，间隔两周后取2 mg纯化的SC蛋白与等体积弗氏不完全佐剂乳化后，以同样免疫方式接种兔子；加强免疫，三免二周后耳静脉注射不加佐剂纯化的SC蛋白进行加强免疫。加强免疫7 d后，耳静脉采血1 mL，37 ℃静置1 h，4 ℃静置2 h 后，3500 r／min 离心10 min，吸取血清，以分离纯化的SIgA为检测抗原，采用琼脂双向免疫扩散检测血清抗体效价，达到要求后，心脏采血，收集血清，分装后于-20℃冷冻保存。

2 结果

2.1 初乳提取物进行SephadexG-200凝胶层析将初乳提取物过SephadexG-200筛凝胶层析，根据洗脱液OD280nm值绘制曲线，第一峰（收集洗脱液第11～36管）为SIgA（含IgG）和第二峰（收集洗脱液第39～44管）为 SC（图1）。

2.2 第一峰液体过DEAE 52离子交换层析柱将第一峰液体浓缩后，测定其蛋白浓度为0.82 mg／mL，取20 mL蛋白液过DEAE 52离子交换层析柱。用0.01 mol／L的 PB液（pH7.4）洗脱后，再用0.1 mol／L的PB液（pH6.8）洗脱。根据洗脱液OD280nm值绘制曲线（图2），第一峰（收集洗脱液第1～40管）为 IgG，第二峰（收集洗脱液第41～65管）为 SIgA。

图2 第一峰液体过DEAE 52柱曲线

2.3 SDS-PAGE分析纯化蛋白的分子量及纯度分离纯化蛋白进行SDS-PAGE，结果表明纯化的SIgA呈现SC、重链和轻链三条带，SC的大小约为70 ku，重链位于66.4和44.3 ku之间约为50 ku，轻链位于29.0 ku和20.1 ku之间约为25 ku。分离的SC的分子量约为70 ku（图3），与报道的大小相近。凝胶薄层扫描分析SIgA和分泌片纯度分别为90%和89%。

图3 提取SIgA和SC的SDS-PAGE结果

2.4 纯化蛋白的鉴定利用琼脂双向免疫扩散鉴定分离纯化蛋白，结果表明纯化的SIgA和SC分别与Anti SC McAb发生了特异性反应（图4）。

图4 纯化蛋白的鉴定结果

2.5 抗SC多克隆抗体的制备以纯化的SC为免疫抗原，以纯化的SIgA为检测抗原，制备抗SC多抗隆抗体，琼脂双向免疫扩散测定血清抗体的效价为1 ∶32。

3 讨论

猪初乳来源相对广泛，富含大量的SIgA和SC，且含杂蛋白较少［12］，有利于蛋白的分离纯化。本实验选取猪初乳作为SC的提取材料。在猪初乳粗提过程中参照了胡正强等分离纯化方法，首先去除乳中的酪蛋白及脂肪等杂质［13-14］，然后根据分离蛋白分子量不同，进行分子筛凝胶层析，将免疫球蛋白与SC分离开，最后根据免疫球蛋白的等电点不同，采用离子交换层析进行分离［15］，提取的SIgA纯度较高，为90%，表明该种方法用于纯化SIgA的效果较好，本研究获得的SIgA可用于多抗制备的检测抗原。

通过凝胶层析分离的SC洗脱液中含有少量的IgG，采用33%硫酸铵盐析后，可以将IgG去除，获得SC的纯度为89%，高纯度免疫抗原的获得对于制备特异性多抗非常重要。陈斌利用制备了抗SC单克隆抗体［16］，单抗制备成本较高，操作繁琐，而多抗制备相对省事省力。

SIgA与血清IgA在免疫学功能上有着显著区别［17］，如何建立有效的方法将SIgA和IgA鉴别开，是准确检测SIgA的关键。血清IgA与SIgA的结构差别在于血清 IgA没有 SC结构［18］，由于 SC是SIgA的特异成分，因而可以应用抗SC特异性抗体检测SIgA。本研究以分离纯化的SC为免疫抗原，制备了效价较高的抗SC的多克隆抗体，以期建立特异的检测粘膜组织中SIgA免疫组织化学方法，为下一步开展粘膜免疫激活剂对粘膜组织中SIgA分泌的影响奠定物质基础。

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