应用猪圆环病毒2型缺失NLS的Cap蛋白建立一种ELISA检测方法

张春雷，陈春丽，王 强，叶 昱，张 杰，谢康尚，靳立明，廖 明，樊惠英

（1.华南农业大学农业部兽用疫苗创制重点实验室，兽医学院，广东 广州 510642；2.广东大华农动物保健品股份有限公司，广东 新兴 527400；3.广东华农温氏畜牧股份有限公司，广东 新兴 527400）

猪圆环病毒2型（PCV2）为单股环状负链DNA病毒，属于圆环病毒科圆环病毒属。PCV2与猪的多种疾病综合征密切相关，包括猪断奶仔猪多系统衰竭综合征（PMWS）、猪皮炎与肾病综合征（PDNS）、猪呼吸系统疾病综合征（PRDC）、母猪的繁殖障碍及仔猪先天性震颤等疾病[1-2]，给养猪业造成了严重的经济损失。

PCV2基因组全长1 767 bp或1 768 bp，共编码11个开放阅读框（Open reading frames，ORFs），其中ORF1和ORF2是两个最大的开放阅读框，分别编码病毒DNA滚环复制相关的蛋白（Rep）和病毒核衣壳蛋白（Cap）[3]。Cap蛋白是病毒的主要结构蛋白，也是主要的免疫原性蛋白[4]。多肽扫描显示，PCV1与PCV2的Cap蛋白上具有共同的抗原决定簇，但血清学试验显示，两种血清型的Cap蛋白没有抗原交叉反应，PCV2的Cap蛋白抗体（或抗原）不能与PCV1 Cap蛋白（或抗体）发生反应，这为建立特异检测PCV2的血清学方法奠定了基础。Cap蛋白在大肠杆菌中的表达已研究得较多，表达产物多以包涵体形式存在[5-6]，导致表达蛋白的活性不理想，限制了其进一步的应用。本试验拟用原核表达的可溶性的SUMO-dCap融合蛋白包被ELISA板，建立检测PCV2抗体的间接ELISA方法。

1 材料与方法

1.1 重组质粒和主要试剂 表达PCV2缺失NLS的Cap蛋白的原核表达质粒（pCold-SUMO-dCap），由本课题组构建[7]，其宿主菌ArticExpress，购自哈尔滨海基生物公司；TMB显色液，购自广州艾铂金斯公司；HRP标记的羊抗猪IgG（H+L），购自广州美津生物公司；PCV2血清抗体ELISA检测试剂盒，购自深圳绿诗源公司。

1.2 血清样品 血清样品采自广东省规模化猪场，共267份，经深圳绿诗源商品化PCV2 ELISA试剂盒检测，再通过间接免疫荧光鉴定，二者鉴定均为阳性的共176份；鉴定均为阴性的共75份；16份为可疑。

1.3 ELISA方法的建立以及条件的优化 采用方阵滴定法测定重组蛋白和待检血清最佳工作浓度。将纯化好的SUMO-dCap融合蛋白分别按60、30、15、7.5、3.75、1.875、0.9375、0.4688 μg/mL倍比稀释包被酶标板，阳性血清和阴性血清分别按1∶20、1∶40、1∶80、1∶160、1∶320、1∶640依次倍比稀释组成方阵，按照间接ELISA程序操作，以阳性血清OD值达到并接近1.0，阴性血清OD值低于0.2，P/N（阳性/阴性）值较大的所在孔的抗原浓度和血清稀释度作为最佳抗原工作浓度和血清稀释度。然后对该ELISA方法的最适抗原包被条件、封闭时间、血清作用时间、酶标抗体稀释倍数、酶标抗体反应时间、底物作用时间进行优化。

1.4 阳性和阴性临界值的确定 随机选取32份猪阴性血清（经PCV2血清抗体ELISA检测试剂盒以及间接免疫荧光试验检测确定为阴性的猪血清），用本研究所建立的间接ELISA方法检测，计算32份猪阴性血清的平均OD450nm值（X）和标准方差（SD），以大于X+3SD判为阳性，小于X+2SD判为阴性，介于两者之间为可疑，建立判定标准。

1.5 SUMO蛋白对照试验 纯化后的SUMO标签蛋白经过稀释，使其浓度和SUMO-dCap蛋白的包被浓度相同，然后包被ELISA板，按照经优化的ELISA程序操作，测定8份阳性血清和8份阴性血清的OD450nm值，检测SUMO标签蛋白对所建立的ELISA方法的影响。

1.6 血清交叉反应试验 用本研究建立的ELISA方法分别检测猪蓝耳病病毒（PRRSV）、猪伪狂犬病病毒（PRV）、猪乙型脑炎病毒（PJEV）、猪口蹄疫病毒（FMBV）和猪瘟病毒（CSFV）阳性血清，同时设立PCV2抗体阴阳性血清对照和空白对照，确定血清交叉反应情况。

1.7 特异性、灵敏性和符合率试验 用本研究所建立的ELISA方法与深圳绿诗源公司的PCV2抗体检测试剂盒平行检测267份猪血清，以深圳绿诗源公司ELISA检测试剂盒作参照，测定本公司的ELISA方法的特异性和灵敏性，并统计两种方法的符合率。

1.8 批内和批间重复性试验 以重组蛋白包被ELISA板，分别取5份阴性和阳性血清进行检测，每个血清样品重复4孔，进行批内重复性试验；再用不同时间制备的三批ELISA板，同时对6份PCV2阳性血清和2份PCV2阴性血清进行批间重复性试验。

2 结果

2.1 ELISA方法工作条件的优化 以SUMO-dCap蛋白为ELISA抗原，抗原包被的最佳工作浓度为0.938 μg/mL，最佳工作条件为4℃包被过夜；以1%BSAPBST为封闭液，于37℃最佳封闭时间为1 h；待检血清最佳稀释倍数为160倍，于37℃最佳作用时间为30min；酶标抗体最佳稀释倍数为10 000倍，于37℃最佳作用时间为30min；以TMB为底物显色液，于室温最佳显示时间为10min。

2.2 阳性和阴性临界值的确定 用本研究建立的间接ELISA方法检测，32份猪阴性血清OD450nm最大值为0.257，最小值为0.094，平均OD450nm值(X)为0.155，标准方差(SD)为0.039。从而得出样本的X+3*SD=0.272，样本的X+2*SD=0.233，将样本OD450nm≥0.272判为阳性，样本OD450nm≤0.233判为阴性，介于二者之间判为可疑。

2.3 SUMO蛋白对照试验 SUMO标签蛋白包被ELISA板，测定8份猪阳性血清和8份猪阴性血清的OD450nm值，结果显示，SUMO标签蛋白包被的酶标板与猪阳性和阴性血清反应的OD450nm值均低于建立的ELISA方法的阴性临界值（0.233）。说明SUMO标签蛋白不干扰建立的ELISA方法的临床应用。

2.4 血清交叉反应试验 用建立的ELISA方法分别检测PRRSV、PRV、PJEV、FMDV和CSFV阳性血清（血清已确定无PCV2阳性抗体），同时设立PCV2抗体阴阳性血清对照和空白对照，确定血清交叉反应情况。结果均为阴性，表明无血清学交叉反应。

2.5 特异性、灵敏性和符合率试验 本ELISA方法与深圳绿诗源公司的ELISA血清抗体检测试剂盒分别对267份猪血清进行平行检测，以深圳绿诗源公司的ELISA检测试剂盒作参照，测定本ELISA方法的特异性、灵敏性及符合率。结果见表1，本研究建立的ELISA方法的特异性为93.33%（70/75），灵敏性为97.16%（171/176），两种方法的符合率为90.26%（241/267）。

表1 间接ELISA方法与试剂盒平行检测比较

2.6 重复试验 同一批次的ELISA板，检测5份血清，各重复4孔，经统计学分析，其变异系数在1.25%～6.37%，说明本ELISA方法批内变异程度较小，具有可重复性。3个批次的ELISA板，检测8份血清，经统计学分析，其变异系数在6.68%～13.58%，表明建立的ELISA方法的批间稳定性较好。

3 讨论

目前，PCV2的检测方法很多，其中PCR技术是进行病原检测和定型的常用方法，但只适用于患病猪在病毒血症时期或排毒时检测，而血清学方法有利于大规模普查。Nawagitgul等[8]以细胞培养的PCV2和重组的PCV2 Cap蛋白建立了两种ELISA方法，其中利用重组Cap蛋白作为ELISA包被抗原比用细胞培养的病毒作为抗原更为有效。Liu等[9]利用杆状病毒表达系统在Sf-21昆虫细胞中表达了PCV2 Cap蛋白，并以此Cap蛋白建立了间接ELISA方法，其特异性和灵敏性分别达到88.5%和89.4%。但是该方法的Cap蛋白的制备是通过包涵体复性而得到，操作繁琐，且培养昆虫细胞成本很高。目前国内市场上的PCV2抗体ELISA检测试剂盒主要是以基因工程表达的Cap蛋白作为包被抗原，如武汉科前、深圳绿诗源、瑞普生物公司等公司的产品。但大多数Cap蛋白表达后是以包涵体形式存在，表达蛋白活性一般，进而会影响到试剂盒的检测效果。所以，本研究以大肠杆菌中高效表达的PCV2可溶性SUMO-dCap融合蛋白作为包被抗原，建立一种PCV2抗体检测ELISA方法。

本研究通过方阵滴定试验确定抗原包被浓度和血清稀释度，抗原的包被浓度对试验的结果有很大影响。抗原浓度过高，会由于抗原蛋白分子之间的相互作用力较大而造成蛋白分子的多层化，影响试验结果；另外，抗原浓度过高还容易造成血清中其他成分与抗原的非特异性结合，从而造成假阳性率升高。由于血清蛋白成分复杂，血清稀释度的高低也会影响试验的特异性和敏感性。在方阵滴定试验中，血清稀释倍数较低时，阴性血清和ELISA抗原的非特异性反应很高；随着血清稀释倍数的增高，阴性血清和ELISA抗原的非特异性反应降低，趋于稳定。试验结果表明，当抗原包被浓度为0.938μg/mL、血清稀释到160倍时，P/N值较大，阴、阳性血清与ELISA抗原的非特异性反应降低到不影响试验结果的程度。另外，在该试验的过程中，发现血清稀释液特别关键。本试验虽然没有对血清稀释液作系统的优化，但是在试验过程中发现如果用PBST作血清稀释液，阴阳性血清反应的OD450nm值均较高，而血清稀释液改为封闭液后，阴性OD值明显降低，P/N值显著增大。

为了检测SUMO标签蛋白对建立的ELISA方法的影响，本研究以0.938μg/mL的SUMO蛋白包被ELISA板，通过不同的阳性血清和阴性血清与其反应。结果显示，其OD450nm值均低于SUMO-dCap蛋白ELISA方法的阴性值，证明SUMO标签蛋白对所建立的ELISA方法干扰作用不明显，可以忽略，同时也进一步验证了SUMO-dCap蛋白可用于建立PCV2血清抗体ELISA检测方法。

本研究建立的ELISA方法与猪蓝耳病病毒、猪伪狂犬病病毒、猪乙型脑炎病毒、猪口蹄疫病毒和猪瘟病毒阳性血清无血清学交叉反应，具有很强的特异性；以深圳绿诗源公司的ELISA检测试剂盒为参照，本研究建立的ELISA方法的特异性为93.33%，灵敏性为97.16%，表明建立的ELISA可信度高；对于重复性试验，批内和批间的变异系数分别为1.25%～6.37%和6.68%～13.58%，结果显示，本ELISA方法批内重复性较好，但是批间的重复性还有待通过对蛋白稳定剂、包被板保存期、稀释液等方面的研究进行优化。本方法的建立，为PCV2的诊断和流行病学调查提供有利的工具，也为研制检测PCV2抗体的ELISA试剂盒奠定了基础。

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