益肾化浊方对SAMP8小鼠NEI网络相关指标的影响

张琳琳 周 震 李 程 张玉莲

(1天津中医药大学第二附属医院，天津，300150;2天津中医药大学，天津，300073)

老年性痴呆即阿尔兹海默病(Alzheimer’s Disease，AD)，是中枢神经系统退行性疾病，以进行性的认知功能障碍和记忆能力损害为主要的临床特征[1]，为痴呆最常见的类型。据中国国家防控中心(CDC)统计，2006年我国AD患病人数已超过500万，60岁以上的老年人群中，年龄每增加5岁，AD的患病危险可增加1.85倍[2]。AD已成为21世纪威胁人类的最严重疾病之一。

AD的病理特征主要包括Aβ聚集形成的老年斑(SP)及tau蛋白异常磷酸化形成的纤维缠结(NFT)最终导致神经元的减少，以往研究多集中于此。而最新研究显示NEI网络在机体衰老过程中具有重要地位，也是老年相关疾患研究中不可避免的重要环节[3]。王拥军团队流行病学调查显示生、长、壮、老的生命过程，其突出表现为NEI网络某些指标的调节变化[4]。因此通过对AD患者紊乱NEI网络的调节，从而达到微环境神经生化指标的良性改变，对于预防和治疗老年性痴呆具有一定作用。而中药复方正是通过采取多靶点作用于失稳NEI网络的方法，起到整体良性调和阴阳的作用，使已经失去平衡的机体重返稳态[5]。

我们在本实验观察了补肾化浊方对SAMP8小鼠神经内分泌免疫系统的影响，并对其机理进行了初步的探讨。

1 材料与方法

1.1 动物分组 健康雄性SAMP8小鼠(由天津中医药大学第一附属医院实验研究中心提供)6、9、12三个月龄各30只，共计90只，体重(30±2)g。三个月龄分别按随机数字表法随机分为安慰剂组、安理申组和益肾化浊方组，共9组，每组10只。见表1。于清洁级实验动物房适应性喂养1周后进行实验，每12 h明暗交替，温度20～22℃，湿度50%左右，饮水、饲料及高温蒸汽灭菌。

1.2 药物制备 益肾化浊方由淫羊藿10 g、补骨脂10 g、女贞子 10 g、石菖蒲12 g、炙黄芪 10 g、川芎 10 g 六种中药组成。上述药物310 g加10倍水，煎煮3次，每次0.5 h，煎煮液浓缩至500 mL，生药浓度为0.62 g·mL－1。以上均由天津中医药大学第二附属医院制剂室制备，4℃冰箱保存备用。盐酸多奈哌齐[商品名:安理申，卫才(中国)药业有限公司提供，5 mg/片]，批准文号:国药准字H20050978，批号:100335A。

人和动物按体表面积折算的等效剂量比值表计算，其中人(70 kg)与小鼠(20 g)间系数为0.0026。按照患者每日62 g(1剂)生药计算，30 g小鼠为每日0.2886 g生药，即生药浓度为9.62 g/kg，因1 mL中药浓煎剂含0.62 g生药，故每日小鼠需13 mL/kg中药浓煎剂。安理申组给药方法为取2片安理申用研钵研磨后混悬于100 mL生理盐水中，即浓度为0.1 mg/mL，按0.01 mL/g给小鼠进行灌胃，2组均连续灌胃4周。

1.3 主要实验试剂和仪器 Elisa试剂盒(包括SAMP8小鼠乙酰胆碱、雌二醇、促肾上腺皮质激素和白细胞介素－2酶联免疫分析试剂盒):购自天津市灏洋生物制剂科技有限责任公司;05－1sR离心机:购自美国Beekman公司;speetraMaxMS全自动酶标仪及Potter－Elvejhem匀浆器:购自美国Mo－eeularDeviees公司;ANDELIN细胞超声破碎仪:购自上海友思生物技术有限公司。

1.4 各指标检测方法 进行4周生理盐水及药物灌胃后，将各组小鼠进行股动脉穿刺取血1 mL，用05－1sR离心机3500 r/min离心15 min后，取上清液放入－80℃冰箱进行保存。利用酶联免疫吸附实验(ELISA)试剂盒对各组小鼠的血清进行NEI网络部分指标的检测，包括:乙酰胆碱、雌二醇、促肾上腺皮质激素及白细胞介素－2。方法操作均按各试剂盒说明书进行。

1.5 统计学方法 实验数据采用SPSS 19.0软件进行统计学处理。计量资料用(±s)表示，组间比较符合正态分布采用t检验(组间进行方差齐性检验，以0.05作为检验水准，方差不齐时选用校正的t检验)，不符合正态分布采用秩和检验;计数资料进行χ2检验。P＜0.05表示差异有统计学意义，P＜0.01表示差异有显著性统计学意义。

表1 实验小鼠分组表(只)

表2 不同月龄小鼠NEI网络相关指标测定(n=10，±s)

表2 不同月龄小鼠NEI网络相关指标测定(n=10，±s)

注:同一月龄小鼠，与安慰剂组比较，*P＜0.05;同一月龄小鼠，与安慰剂组比较，△△P≤0.001;▲P＞0.001。

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2 结果

1)本研究结果表明老年痴呆小鼠的乙酰胆碱、雌二醇及肾上腺皮质激素的水平明显减低，IL－2的水平明显增高。见表2。

2)安理申与益肾化浊方9、12月龄小鼠的乙酰胆碱水平较同月龄安慰剂组都有明显的升高作用(P＜0.05)。见表2。

3)益肾化浊方组9、12月龄小鼠在乙酰胆碱、雌二醇及肾上腺皮质激素水平较同月龄安慰剂组明显升高(P＜0.05);IL－2较同月龄安慰剂组明显减低(P＜0.05)。见表2。

4)9月龄小鼠安理申组的乙酰胆碱水平及同月龄益肾化浊方组的乙酰胆碱、雌二醇、肾上腺皮质激素及IL－2水平较同月龄安慰剂组变化差异有统计学意义(P≤0.001);12月龄月龄小鼠安理申组的乙酰胆碱水平及同月龄益肾化浊方组的乙酰胆碱、雌二醇、肾上腺皮质激素及IL－2水平较同月龄安慰剂组变化差异有统计学意义(P＞0.001)。P值越小，差异越明显。见表2。

3 讨论

NEI网络学说最初在1977年由Basedovsky提出，该学说认为，看似独立的神经、内分泌、免疫三大系统，实际上是一个有着广泛联系的有机整体，三大调节系统之间存在着精密完整复杂的信息传递机制[6]。生理状态下，NEI网络各系统间通过自分泌或旁分泌方式维持着动态平衡，通过相互刺激、相互制约，达到系统内部的自我调剂和相对稳定;但病理状态下，某些因子的异常变化可诱发一系列的连锁反应，使稳态偏离，造成疾病出现[7]。NEI网络自稳调节紊乱是所有疾病的共同本质。AD是一种常见于老年人的神经系统变性疾病，其病程长，致残率高，目前治疗该病尚无有效的药物和方法。

乙酰胆碱(Ach)是脑内与学习、记忆密切相关的神经递质，生物化学研究发现AD患者脑内乙酰胆碱能神经元缺少，Ach含量不足。胆碱酯酶抑制剂可抑制中枢突触间隙的胆碱酯酶，阻止Ach的分解，修复AD患者中已丧失的胆碱能功能[8]。血浆肾上腺皮质激素(ACTH)和皮质醉含量的减低可引起下丘脑一垂体一肾上腺皮质轴(HPA)系统功能的改变[9]，亢进的HPA轴可参与衰老相关的机体组分、代谢改变及脑老化[10]。研究表明，AD患者血清中睾丸酮及雌二醇水平明显降低[11]。Pierschmann 等[12]研究发现老年人 IL－2、IL－4及IL－13的水平会显著增高。近年研究发现白介素(IL－1、IL－2、IL－6、TNF、TGF)等细胞因子在AD病灶区大量表达，不仅与神经元死亡及神经细胞凋亡密切相关，而且促进细胞黏附分子等的表达，在AD发病中发挥重要作用。本研究同样发现AD小鼠体内Ach、雌二醇及ACTH的水平明显减低，IL－2的水平明显增高。

淫羊藿味辛甘性温，补肾阳、益精气，是常用的延年益寿药物。现代研究表明，淫羊藿主要成分为淫羊藿总黄酮和淫羊藿多糖等[13]，具有抗衰老、保护心脑血管及增强免疫等药理活性[14]。另外，其还具有较强雌激素活性[15]。女贞子味甘苦性凉，滋补肝肾、填髓益精。其具有抗炎、抗衰老、降血糖、降血脂、血管保护及提高免疫功能等药理作用[16]。而淫羊藿与女贞子配伍，更使其平补阴阳、益肾填精的功效倍增。黄芪补心脾、益气血。现代研究表明黄芪具有扩张血管、抗血栓、抗自由基、调节免疫等作用[17]。其能有效阻止大脑皮层和海马区的神经轴突和突触的消失;上调ACTH、皮质醇及升高 CD3+、CD4+、CD4+/CD8+细胞平均百分率水平;降低IL－2、IL－6、TNF－α和INF－γ的mRNA表达水平[18]。补骨脂味辛苦性温，壮腰益肾。现代研究表明其可通过提高下丘脑－垂体－性腺轴的敏感性，从而影响血清中雌激素和睾丸酮含量，发挥双向调节作用[19]。石菖蒲能够化痰开窍、醒神益智。其内含的挥发油和细辛醚有较强抑制乙酰胆碱酯酶活性的作用[20]。川芎其味辛性温，善通利血脉，芳香走窜，能升能降，善于上行头目，入脑开闭，可使血行流利，脑络通畅。其内含的川芎嗪易通过血脑屏障，可起到扩张脑血管、增加血流量的目的。本研究表明诸药合用可升高AD小鼠体内Ach、雌二醇及ACTH的水平，降低IL－2的水平，从而起到调节NEI网络平衡，防治AD疾患的作用;而安理申组仅Ach的水平可得到升高。表明中药复方可通过整体多靶点作用于失稳的NEI网络，达到防治AD的作用。

另外，本研究还发现，9月龄小鼠安理申组的Ach水平及同月龄益肾化浊方组的Ach、雌二醇、促肾上腺皮质激素及IL－2水平较同月龄安慰剂组变化差异有统计学意义(P≤0.001);12月龄月龄小鼠安理申组的Ach水平及同月龄益肾化浊方组的 Ach、雌二醇、ACTH及IL－2水平较同月龄安慰剂组变化差异有统计学意义(P＞0.001)。P值越小，代表差异越明显。提示AD疾病的早期干预可能对其治疗效果会产生更为明显的作用。

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