β－淀粉样蛋白与载脂蛋白E4对大鼠海马突触素的影响

崔丽霞，郭 锋，李新毅

(1长治医学院附属和平医院神经内科，长治 046000;2吕梁市人民医院神经内科;3山西医科大学附属大医院神经内科;*通讯作者，E-mail:xinyili2003@aliyun.com)

阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)是一种原因未名的慢性进行性神经系统疾病，临床特征为隐袭起病、持续进行性智能衰退而无缓解。研究表明Aβ在脑内的异常沉积是AD发病较为初始的因素。载脂蛋白E(apolipoprotein E，apoE)在AD发生发展中所起的作用越来越受到关注。其结构基因存在多态性，基因型ε4是AD的高危因素和易患因素，ε4对应的蛋白质apoE4和Aβ的结合可能促进了AD的发生［1］。AD患者重要的组织形态学改变之一是突触脱失，其程度与痴呆严重程度平行。突触素(synaptophysin，SYN)作为突触前终末的特异性标记物，可用来检测突触的密度和分布。我们首次采用海马注射Aβ与ApoE4模拟AD的病理特征，并通过检测SYN探索Aβ与ApoE4在AD发病机制中的作用及二者间是否存在协同作用。

1 材料和方法

1.1 材料

健康雄性Wistar大鼠24只，体重200－300g，鼠龄60 d。脑立体定位仪购自深圳市瑞沃德生命科技有限公司。Aβ1－40购自中山生物工程有限公司。apoE4购自英国 Immunokontact公司。兔抗鼠突触素单克隆抗体，二抗羊抗兔均购自武汉博士德生物工程有限公司。MIAS－2000图像分析系统购自四川大学智胜软件股份有限公司。

1.2 分组

24只大鼠腹腔注射D－半乳糖6周后，用随机数字表法均分为4组:对照组双侧海马注射生理盐水，每侧2 μl;Aβ 组双侧海马注射5 μg/μl的 Aβ1－40，每侧2μl;apoE4组双侧海马注射0.5μg/μl的apoE4，每侧2μl;Aβ+apoE4组双侧海马注射每侧10μg/μl Aβ1－401 μl+1 μg/μl apoE4 1 μl。

1.3 动物模型制备

以颗粒型普通大鼠饲料(含蛋白质23.00%、脂肪4.70%、钠盐0.24%)喂养，饮用自来水，动物房温度控制在20℃左右，正常昼夜节律。首先予以腹腔注射D－半乳糖50 mg/(kg·d)6周致衰;之后海马注射:10%水合氯醛(3 ml/kg)腹腔注射麻醉大鼠，做颅顶正中切口，参照 George Paxinos的《The Rat Brain In Stereotaxic Cordinatcs》，在脑立体定位仪操纵下于前囟后3.0 mm分别向中线左右两侧旁开2.0 mm处，牙科钻钻开颅骨，5μl微量注射器自颅骨表面垂直进针4.0 mm，分别将生理盐水、Aβ1－40、apoE4、Aβ1－40+apoE4混合液2 μl缓慢注入双侧海马，术后保温至清醒。

1.4 Morris水迷宫检测

水迷宫测试实验:海马注射15 d后进行5 d定位航行试验。水池被平均分为4个象限，将大鼠面向池壁放入水中，记录每次试验中大鼠从入水点到发现并爬上水下平台的时间，为逃避潜伏期(escape latency，EL)。大鼠自由游泳最长时限120 s，大鼠120 s内未能发现平台，就将其置于平台上10s，此时的EL记为120 s。每1只大鼠一个上午或下午进行4次连续训练，每次训练间隔为60 s。1只大鼠1 d的EL的平均值就是平均逃避潜伏期(the average escape latency，AEL)。定位航行试验后撤除平台，在同一入水点将大鼠面壁投入水池，摄像机记录其60 s内水中游泳路径，电脑分析计算大鼠穿越平台次数。

1.5 制备免疫组化切片

将大鼠用10%水合氯醛(3ml/kg)腹腔注射麻醉，经左心室向升主动脉插管，剪开下腔静脉，同时快速灌注肝素化生理盐水(50 U/ml)120 ml(滴速为10 ml/min)以清除血管内血液，断头取脑，将大鼠海马组织固定于4%的多聚甲醛溶液24 h后石蜡包埋，冠状切片(厚度2－3μm)。

1.6 免疫组织化学检测突触素的表达

取石蜡切片采用SABC法检测抗体的表达，步骤如下:①切片脱蜡;②灭活内源性酶;③热抗原修复;④滴加5%BSA封闭液;⑤滴加稀释的一抗突触素(1∶200);⑥滴加生物素标记的相应的二抗;⑦滴加过氧化物酶标记的链霉素－亲和素复合物(SABC);⑧抗原染色;⑨复染;⑩树胶封片。

用MIAS－2000图像分析系统测定海马CA1区SYN的OD值。同时测定相应每张切片胼胝体OD值作背景，免疫反应物的OD值减去背景OD值得到校正OD值(COD值)，即免疫反应物的OD值。每例标本测5张切片，每张切片的每个测定部位随机选取三个视野，取平均值。所有OD值测定均在相同的光学条件下完成。

1.7 统计学分析

2 结果

2.1 定位航行试验

在5 d的定位航行实验中，各组大鼠逃避潜伏期随着游泳天数的增加有不断缩短的趋势(见表1，2)，表明各组大鼠在5 d的游泳训练中对寻找平台均有一定的学习记忆能力。从第5天大鼠的游泳轨迹图可以看出，对照组大鼠很快能找到平台位置，apoE4组大鼠运动轨迹多位于平台所在象限，而Aβ组、Aβ+apoE4组大鼠多围绕池壁游泳，在迷宫外环停留时间较长，较少游向平台附近，其运动轨迹随机分布于各象限中，以 Aβ+apoE4组更为明显。apoE4组、Aβ组与对照组比较，大鼠第5天的逃避潜伏期明显延长，差异有统计学意义(P＜0.01)。Aβ组与apoE4组比较，大鼠第5天的逃避潜伏期明显延长，差异有统计学意义(P＜0.01)。Aβ与apoE4 之间存在交互作用(F=7.098，P＜0.01)，Aβ+apoE4组与Aβ组、apoE4组比较，大鼠第5天的逃避潜伏期均明显延长，即二者具有协同作用。

表1 不同干预后大鼠第5天的逃避潜伏期(±s，s)Table 1 Changes of escape latency after different intervention at 5 d(±s，s)

表1 不同干预后大鼠第5天的逃避潜伏期(±s，s)Table 1 Changes of escape latency after different intervention at 5 d(±s，s)

不用43.50±9.78 10.75±2.44

表2 大鼠第5天的逃避潜伏期变化的析因设计方差分析Table 2 Variance analysis of escape latency after different intervention at 5 d

2.2 Aβ与apoE4对大鼠跨台次数的影响

用2×2析因设计的方差分析法进行统计处理，结果显示，apoE4组、Aβ组与对照组间比较，大鼠跨台次数明显减少，差异有统计学意义(P＜0.01，见表3，4)。Aβ组与apoE4组比较，大鼠跨台次数明显减少，差异有统计学意义(P＜0.01)。Aβ与apoE4 之间存在交互作用(F=7.230，P＜0.01)，Aβ+apoE4组大鼠跨台次数均明显少于单用Aβ组及单用apoE4组，即二者具有协同作用。

表3 不同干预后大鼠的跨台次数(±s)Table 3 Changes of times of passing platform after different intervention(±s)

表3 不同干预后大鼠的跨台次数(±s)Table 3 Changes of times of passing platform after different intervention(±s)

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表4 大鼠跨台次数变化的析因设计方差分析Table 4 Variance analysis of times of passing platform after different intervention

2.3 各组大鼠海马CA1区SYN OD值比较

apoE4和Aβ对大鼠海马CA1区SYN免疫反应阳性产物的光密度值下降的主效应均有统计学意义(P＜0.01，见表5，6)，Aβ 与 apoE4 对 SYN 光密度值下降具有交互作用(P＜0.05);表明单独用Aβ或apoE4均可导致海马结构内CA1区SYN光密度值下降，并且两者间存在交互作用。

表5 不同干预后大鼠海马CA1区SYN OD值(±s)Table 5 Changes of optical density of synaptophysin in hippocampus CA1 region after different intervention(±s)

表5 不同干预后大鼠海马CA1区SYN OD值(±s)Table 5 Changes of optical density of synaptophysin in hippocampus CA1 region after different intervention(±s)

不用0.551±0.032 0.759±0.043

表6 大鼠海马CA1区SYN OD值析因设计方差分析Table 6 Variance analysis of optical density of synaptophysin in hippocampus CA1 region after different intervention

3 讨论

Morris水迷宫可以检测与海马功能直接相关的空间学习记忆的形成和维持，被广泛应用于神经生物学研究领域。我们采用Morris水迷宫测定各组大鼠学习能力发现:apoE4组、Aβ组与对照组比较，大鼠第5天的逃避潜伏期明显延长、跨台次数明显减少;Aβ+apoE4组与Aβ组及apoE4组比较，平均潜伏期明显延长、跨台次数明显减少，可见双侧海马注射apoE4、Aβ、Aβ+apoE4均可使大鼠学习记忆能力下降，而Aβ与apoE4对学习记忆的损害具有协同作用。

AD是一种老年性疾病，人或者动物衰老时，智力水平及体内物质代谢、内环境稳态等均与年青时不同，因D－半乳糖长期注射，可以引起机体脂质氧化亢进，脑功能减退，转录水平减低，神经元RNA、蛋白总量下降，核固缩甚至神经细胞数目减少，故本实验用长期大量注射半乳糖的方法来代替自然衰老鼠。

海马直接参与信息的储存与回忆，存在两个回路与学习记忆有关，一个是经典的帕帕兹环路(Papez circle)，另一个是三突触回路(trisynaptic circuit)。海马→穹窿→乳头体→乳头丘脑束→丘脑前核→扣带回→海马，这条环路就是帕帕兹环路。三突触回路即内嗅皮层通过穿通纤维与齿状回颗粒细胞形成突触联系，而颗粒细胞发出苔状纤维与CA3区锥体细胞形成突触联系，再由CA3区锥体细胞发出的Schaffer侧支与CA1区锥体细胞形成突触联系。而CA1区锥体细胞发出纤维出海马至下托，由下托发出纤维返回内嗅皮质。近年来的研究证实，三突触回路具有特殊的机能特性，与学习记忆的形成密切相关［2］。已有研究证实，AD患者海马结构内突触素含量比正常人明显减少［3］，故本实验采用海马注射方法。

突触是神经元之间的连接点，是信息传递的基础，多突触连接形成神经回路。SYN是突触囊泡膜上的特异性蛋白质，其胞质羧基末端可结合Ca2+，是突触囊泡钙结合蛋白之一，可被酪氨酸蛋白激酶磷酸化，对突触囊泡的胞吐起重要作用［4］。SYN在神经元核周体的内质网合成，然后转运到高尔基复合体进行加工，在囊泡中被运至突触活化区，参与突触囊泡的导入、转运、神经递质的释放、突触囊泡再循环和突触发生。除了突触囊泡外，线粒体、胞膜、突触后膜均无突触素。突触素的减少意味着突触囊泡转运能力减弱，传递效能减弱。

Aβ的神经毒性作用已被证实。以往的研究表明，自然分泌的Aβ低聚物(oligomers)可以在生理水平明显抑制大鼠海马的突触传递，提示可溶性Aβ低聚物可导致AD脑内突触功能障碍和突触丢失。我们采用海马注射可溶性Aβ，结果显示海马注射可溶性Aβ后动物的学习记忆功能受损、大鼠海马SYN OD值明显下降。说明可溶性Aβ可以导致AD的重要病理特征即突触受损及主要的临床表现学习记忆功能受损。

apoE4对神经元的影响报道不多，有研究表明ε4基因型的个体与非ε4基因型的个体相比较，更易出现额叶局部萎缩［5］。本实验结果提示，单纯apoE4即可致SYN OD值下降，突触囊泡转运能力减弱，传递效能减弱，从而使动物的学习记忆功能受损。

我们通过在体Aβ联合apoE4海马注射的方法，并用析因设计方差分析证实 Aβ与apoE4对SYN OD的影响具有协同作用，说明apoE4有协同Aβ神经毒性效应的作用。这与细胞水平及国外研究相一致［6－8］。2000年郭文平等［6］在细胞水平的研究提示apoE4可能对Aβ神经毒具有协同作用。Smach等［7］研究提示AD患者中携带apoE4基因者脑脊液中 Aβ的含量比未携带者更低。在 APPV717F+/－转基因小鼠体内的研究也发现，apoE以亚型特异性方式促进Aβ的沉积［8］。与apoE3个体相比较，apoE4的个体脑内高水平的Aβ低聚物可使树突减少，加重记忆损害，导致AD患者近记忆力下降［9］。推测apoE4促进Aβ的沉积可能机制包括:①apoE4可以增加Aβ的形成［9］，使随机螺旋结构变为片层结构，因而更易聚集成为纤维样结构，产生淀粉样斑块。②apoE4与Aβ直接结合形成不易清除的复合物，能够很强地稳定Aβ低聚物，这种改变导致AD［10］。③通过细胞内机制增加Aβ神经毒性。Aβ联合apoE4海马注射后，使更多Aβ进入细胞内，诱导其细胞内机制，促发一系列细胞毒性作用。

我们以海马CA1区SYN作为检测指标，用Aβ联合apoE4注射于致衰大鼠海马，模拟出AD的病理改变—突触脱失及临床特征—学习记忆功能障碍，提示apoE4有协同Aβ神经毒性效应的作用，其具体的相互作用机制尚待进一步深入研究。

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