SREPS对肝癌H22荷瘤小鼠的抑瘤作用

程红兵，陈云霞，张雄鹰，赵良启，曹艳芳

(1长治医学院微生物学教研室，长治 046000;2山西大学化学生物学与分子工程教育部重点实验室;3长治医学院附属和平医院;*通讯作者，E-mail:liangqi@sxu.edu.cn)

多糖是一类醛糖或酮糖组成的生物高分子，可以传递细胞之间大量的生物信息，在应用研究上，对多糖分子进行适当的分子修饰和结构改造，使其具有更多的生物活性或强化已有的生物活性，能更广泛地应用于临床［1，2］。多糖的硫酸酯化是多糖结构修饰的研究热点，实验表明硫酸酯化多糖具有抗肿瘤、抗病毒、提高免疫力等作用。

本实验室获得一株根瘤菌(Rhizobium sp.N613)，能产生丰富的胞外多糖(REPS)［3，4］。本研究采用氯磺酸－吡啶法对REPS进行硫酸酯化修饰，得到硫酸酯化胞外多糖(sulfated rhizobium exopolysaccharide，SREPS)，观察SREPS的抑瘤作用，以探讨其抗肿瘤的作用机制，为临床治疗肿瘤提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物和细胞株

昆明种小鼠，体重(20±2)g，购自山西医科大学实验动物中心。小鼠肝癌细胞株(H22)，由山西省肿瘤医院实验动物中心提供，本室以腹水型传代保种。

1.2 药物

Rhizobium sp.N613 胞外多糖(REPS)，由本实验室以Rhizobium sp.N613为生产菌株发酵纯化制得，分子量为37.52 kD。利用氯磺酸－吡啶法对REPS进行硫酸酯化修饰，获得SREPS。环磷酰胺(江苏恒瑞医药股份有限公司)。

1.3 试剂和仪器

生理盐水(山东康宁药业有限公司)。日立U－2010紫外分光光度计(日本日立公司)，恒温振荡器(太仓市科学仪器有限公司)，电子天平(上海精密科学仪器有限公司)。

1.4 急性毒性实验

选取健康昆明种小鼠，雌雄各半，每组10只，阴性对照组、4个实验组分别采用蒸馏水、SREPS1.25 g/kg、2.50 g/kg、5.00 g/kg 和 10.00 g/kg 灌胃。灌胃前各组小鼠均禁食16 h，灌胃后12 h喂食，饲养观察10 d。记录动物死亡数目、体重增长和进食等情况，确定SREPS的半数致死量(LD50)。

1.5 SREPS对小鼠H22的抑制作用

抽取腹腔接种H22细胞8－10 d的小鼠腹水，用无菌生理盐水稀释成细胞数为1×106ml的瘤细胞悬液，选70只小鼠，每只小鼠于右前肢腋皮下接种0.2 ml。次日随机分7组，每组10只，雌雄兼用且分养。SREPS 用无菌水配制为 0.5，1，2.5，5，10 mg/kg溶液，接种后24 h腹腔注射给药，模型组腹腔注射生理盐水，阳性对照组腹腔注射环磷酰胺(Cy)，每日一次，每次均 0.4 ml，连续给药 10 d。于末次给药后24 h，小鼠称重，处死小鼠剥取瘤块，摘取脾脏和胸腺，称重，计算抑瘤率、胸腺指数和脾指数。肿瘤抑制率(%)=(荷瘤对照组平均瘤重－实验组平均瘤重)/荷瘤对照组平均瘤重×100%

1.6 统计学分析

数据分析采用SPSS13.0统计软件进行组间方差检验，P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 急性毒性实验

给药后小鼠行为活动、食欲、毛色等均正常，体重与阴性对照组差异无统计学意义(P＞0.05，见表1)，未见有药物引起的病变和中毒现象，实验过程小鼠无死亡，说明SREPS的LD50＞10 g/kg。按照我国五级急性毒性分级标准，SREPS属于微毒物质，对实验动物无急性毒性作用。

表1 急性毒性实验结果Table 1 Results of the acute toxicity test

2.2 对小鼠H22肉瘤的抑制作用

SREPS各剂量组对小鼠H22肉瘤均有一定抑制作用，与模型组相比，差异有统计学意义 (P＜0.01，见表2)，其中 SREPS 以剂量为 2.5 mg/kg 的抑瘤率最高，达34.90%。虽然环磷酰胺组的抑瘤率最高，达到49.40%，但该组小鼠体重的增加值显著小于其他各组，可能是由于其强烈的毒副作用所致。而SREPS各剂量组对小鼠的体重增加无明显影响。该试验结果表明，各剂量组SREPS对小鼠肉瘤H22肉瘤均有良好的抑瘤作用，且具有良好的生物相容性。

表2 SREPS对H22荷瘤小鼠瘤体生长的影响Table 2 Effects of SREPS on tumor weight in H22 tumor-bearing mice

2.3 对荷瘤小鼠胸腺指数和脾指数的影响

从表3中可以看出，环磷酰胺组的胸腺指数和脾指数降低，与模型组相比差异有统计学意义(P＜0.01);而SREPS各剂量组较模型组的胸腺指数和脾指数升高，其中2.5 mg/kg剂量组对荷瘤小鼠胸腺指数和脾指数均有作用，差异有统计学意义(P＜0.05)。说明各剂量组SREPS对荷瘤小鼠胸腺和脾有保护作用。

表3 SREPS对荷瘤小鼠胸腺指数、脾指数的影响Table 3 Effects of SREPS on thymus index and spleen index in H22 tumor－bearing mice

3 讨论

硫酸酯化多糖是指含硫酸基团的天然及半合成的多糖，为聚阴离子化合物。近年来发现硫酸酯化多糖具有抑制艾滋病病毒的活性［5］，使硫酸酯化多糖的研究成为热点。继而研究发现硫酸酯化多糖还具有抗肿瘤、抗氧化、增强免疫力等活性［6－8］。本实验室从一株根瘤菌(Rhizobium sp.N613)发酵液中提取分离胞外多糖(REPS)，采用氯磺酸－吡啶法对REPS进行硫酸酯化修饰，得到硫酸酯化 REPS(SREPS)。本试验结果显示，小鼠对 SREPS的LD50＞10 g/kg，表明SREPS为低毒物质。各剂量组SREPS对荷瘤小鼠体内的肿瘤增长均具有一定的抑制作用，其中SREPS以剂量为2.5 mg/kg的抑瘤率最高，达34.90%。虽然环磷酰胺组的抑瘤率最高，但环磷酰胺在抑制肿瘤的同时对荷瘤小鼠的体重有一定的影响，对小鼠的胸腺指数、脾指数均有显著的抑制，说明环磷酰胺可能导致脾和胸腺萎缩，进而导致荷瘤小鼠免疫功能低下，长期使用该药物对机体有较大的损害。而各剂量组SREPS对荷瘤小鼠的体重、胸腺指数和脾指数均无明显影响，且2.5 mg/kg剂量组对荷瘤小鼠胸腺指数和脾指数有显著升高。表明各剂量组SREPS在抑制肿瘤的同时对荷瘤小鼠的免疫功能无影响，有些剂量还可促进其免疫功能增强。从胸腺指数和脾脏指数的变化情况来看，该硫酸酯化多糖制剂可能是通过增强机体自身的免疫力来达到抑瘤效果的。

SREPS作为一类天然半合成制剂，对肝癌H22小鼠有一定的抑瘤作用。其作用机制尚不清楚，还有待进一步研究。

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