透明质酸钠预防大鼠术后腹膜粘连实验研究＊

西安医学院临床医学院（西安710021） 封怀安 王 康 魏光兵

腹膜粘连是腹、盆腔手术后常见的并发症，其发生率为79%～93%［1］。目前多认为是手术创伤、感染、异物反应、组织缺血、局部放疗或化疗等的结果［2］。腹腔粘连患者中约40%发生不同程度的肠梗阻，是急性复发性肠梗阻的最常见原因，并与女性不育、腹痛和盆腔痛直接相关［3］。本实验应用透明质酸钠进行预防腹膜粘连的实验研究，旨在探讨其对腹膜粘连的预防效果。

材料与方法

1 实验动物与材料 选用健康S-D（Sprague Dawley）大鼠60只，雌雄各半，体重250～300g（由西安交通大学实验动物中心提供）。医用透明质酸钠由上海华源生命科学研究开发有限公司提供。

2 方 法

2.1 实验动物模型制备及分组

A组：创伤组20只，术前禁食10～12h，以2%戊巴比妥钠30mg／kg腹腔注射麻醉，仰卧位固定于鼠板上，取下腹正中入腹，在右髂窝处找到膨大的盲肠，用止血钳钳夹盲肠壁及相对壁腹膜，直至点状出血，面积约1.5cm×2.5cm，顺肠管走形排列好肠袢，保证受伤的腹膜肠管相对在一起，避免损伤其它脏器及腹膜，逐层关腹。术后禁食12h，用标准颗粒混合饲料（由西安交通大学实验动物中心提供）喂养。

B组：创伤+透明质酸钠组20只，按照A组方法建立创伤模型于关腹前在创伤部位均匀涂抹医用透明质酸钠约1ml，术后喂养同A组。

C组：对照组20只，仅行开关腹手术，术后喂养同前。

2.2 观察与检测指标

2.2.1 观察粘连情况及组织标本的采集：分别于术后第1、3、5、7d脱臼处死动物，打开腹腔，肉眼观察粘连情况及程度，按照Nair［4］粘连分级标准进行评分，0级：完全无粘连；1级：单个纤细粘连；2级：单个或两个轻度粘连，粘连宽度＜1㎝；3级：重度粘连，两个以上粘连或一个粘连宽度＞1㎝；4级：广泛的或切口下的粘连。分级后按级数打分，0级为0分，1级为1分，依此类推4级为4分。然后，切取粘连或损伤组织（包括一部分肠管和相对的腹膜），10%甲醛浸泡24h后常规石蜡包埋，待检。

2.2.2 链霉亲和素免疫组化法（Strept-Avidin-Biotin-enzyme Complex，SABC）检测TGF-β1：按照说明书操作，TGF-β1免疫组化试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司，阴性对照由PBS替代一抗，由已证实的阳性片作对照。用Q5SOCW图像信号采集与分析系统检测灰度值，每张切片随意取3个不同视野检测，取其平均值。

2.3 统计学方法：应用SPSS13.0统计学软件处理，粘连分级评分采用秩和检验，免疫组化染色结果比较采用方差分析，以P＜0.05认为有统计学意义。

结 果

1 粘连评分结果 A组有1只大鼠术后第1天内死亡，尸检可见：腹腔广泛混浊污液，有恶臭，钳夹的盲肠有穿孔，肝脾肾均有坏死灶，腹腔无粘连形成，分析死于中毒性休克。其余动物粘连评分见表1。经统计学检验发现，术后1、3d粘连评分无明显差异（P＞0.05），3、5、7d间粘连评分有显著性差异（P＜0.05）。说明术后3～7d是粘连形成的关键时期。

B组粘连评分见表2，经统计学检验1、3、5、7d粘连分级无显著性差异（P＞0.05）。本组5、7d粘连评分明显低于A组同时间点粘连评分（P＜0.05）。这说明透明质酸钠可减少术后腹膜粘连的程度。

C组动物无粘连形成，评分见表3。

2 免疫组化结果 A、B组TGF-β1表达定位于粘连组织的巨噬细胞中，呈较一致的阳性反应，棕黄色的阳性物质都沉积于巨噬细胞的胞浆中；对照组TGF-β1同样定位于组织的巨噬细胞中，但呈弱阳性的反应或不表达，由表4和附图可见三组染色灰度值结果。A、B组术后各时间点灰度值均较对照组低（P＜0.01），有统计学意义，B组较A组表达明显减少（P＜0.01）。由此可见，透明质酸钠能明显减少术后粘连组织中TGF-β1的表达，有一定的防粘连作用。

表1 A组动物腹膜粘连情况（只）

表2 B组动物腹膜粘连情况（只）

表3 C组动物腹膜粘连情况（只）

附图 各组术后TGF-β1的表达灰度值

表4 各组术后TGF-β1表达灰度值（±s）

表4 各组术后TGF-β1表达灰度值（±s）

组别 1d 3d 5d 7d A组 191.60±5.14 188.24±2.42 165.08±1.54 165.68±1.57 B组 210.99±0.80 206.46±1.90 199.98±0.64 199.92±0.58 C组 215.31±0.92 214.04±1.09 213.16±0.80 212.95±0.88

讨 论

我们在实验中动态观察大鼠腹膜粘连形成时发现，在腹膜粘连形成的自然过程中，术后第1天和第3天的粘连评分没有差异，而3、5、7d时的粘连评分是有显著性差异的，说明粘连形成的关键时期是术后3～7d。这提示我们，预防腹膜粘连的药物应在此时间段发挥作用。

透明质酸是一种酸性粘多糖。它是人体内的一种正常的糖胺聚糖，分布于人体结缔组织细胞外基质中，在生理浓度时，透明质酸分子相互缠绕并形成无序纤维网络，构成其特有的三维结构，有些大分子，如纤维蛋白原、胶原和蛋白多糖是很难进入网络结构的。它以胶体状态进入腹腔，接触到损伤的腹膜后，形成一种胶冻状物质，覆盖于受损伤腹膜的表面，从而隔离开受损伤腹膜面的直接有效接触。透明质酸钠是透明质酸的钠盐形式，是一种天然降解具有吸收性的生物医学材料。一般术后腹膜粘连形成需要7d左右，我们的实验观察在术后7d仍见有未完全降解的透明质酸钠。可见透明质酸钠真正起到了良好的隔离作用。本试验结果显示透明质酸钠明显降低了腹腔粘连程度。

TGF-β是启动和终止组织修复的一种主要细胞因子，是细胞生长的双向调节剂［5］，哺乳动物中TGF-β有三种类型，即 TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3，不同的器官表达不同的TGF-β，表达量与粘连形成有关，腹腔器官、浆膜组织及粘连部位表达TGF-β1、TGF-β3增多，其中TGF-β1在组织损伤中效应最强，在腹膜粘连过程中有重要作用。它能向临近细胞发出信号，调节损伤组织重建的全过程。在腹膜粘连过程中，TGF-β可能在损伤、炎症及纤维化之间起桥梁作用［6］，腹膜损伤后血小板和巨噬细胞释放TGF-β，启动一个连锁反应，破坏了纤维蛋白溶解与合成之间的平衡，同时还导致细胞外基质的沉积，从而促进了腹膜粘连的形成。在本实验中我们证实应用透明质酸钠组动物腹膜损伤部位的TGF-β1表达明显低于创伤组，说明透明质酸钠对TGF-β1的表达有明显的抑制作用，从而证明透明质酸钠预防术后腹膜粘连形成的一条重要机制在于抑制损伤组织中细胞因子的水平，尤其是TGF-β1的表达水平，从而起到抗粘连的作用。

总之，本实验初步认为透明质酸钠预防术后腹膜粘连的机制可能在于：①透明质酸钠能在损伤局部起到良好的隔离作用；②减少损伤局部的炎细胞渗出，减少胶原蛋白的沉积，促进损伤组织的生理性修复；③透明质酸钠能够抑制损伤组织愈合过程中TGF-β1的过量合成及表达。

［1］Rout UK，Diamond MP.Role of plasminogen activators during healing after ulterine Serosal lesioning in the rat［J］.Fertil Steril，2003，79（1）：138-145.

［2］Liakakos T，Thomakos N，Fine PM，et al．Peritoneal adhesions：Etiology，pathophysiology，and clinical significane.Recent advances in prevention and management［J］.Di Surg.2001，18（1）：260-273.

［3］Greene AK，Alwayn IP，Nose V，et al.Prevention of intra-abdominal adhesions usingthe antiangiogenic COX-2 inhibitor celecoxib［J］.Ann Surg，2005，242（1）：140-146.

［4］Tsai SW，Fang JF，Yang CL，et al.Preparatioin and evaluation of hyaluronate-collagen film for preventing postsurigal adhesion［J］.Int Med Res，2005，33（1）：68.

［5］Herndon DN，Nguyen TT，Gilpin DA.Growth factors local and systemic［J］.Arch Surg，2003，128：1227-1233.

［6］翁永强.β-生长因子与腹膜粘连［J］.国外医学，2000，27（2）：94-96.