BMP-7对大鼠脑缺血再灌注损伤后Caspase-9表达的影响

裴海涛， 曹东明， 李红云， 郭壮丽

骨形态发生蛋白-7(bone morphogenetic protein-7，BMP-7)是β转化生长因子(TGF-β)超家族中的一员，广泛应用于开放性骨折及脊柱融合术中［1］。近年研究发现，大鼠脑缺血后，BMP-7能够通过血脑屏障达缺血侧脑组织，并且促进大鼠神经功能恢复［2］。体外细胞培养证实，BMP-7能抑制低钾引起的神经细胞凋亡，具有抗凋亡作用［3］。动物实验研究表明，BMP-7可抑制大鼠大脑中动脉缺血再灌注后的细胞凋亡，但是其作用机制仍十分不清楚［4］。细胞凋亡是脑缺血再灌注损伤的重要机制，主要由特异性半胱氨酸蛋白酶(Caspase)介导，其中Caspase-9是细胞凋亡线粒体通路的重要启动酶［5］。本实验通过观察BMP-7对大鼠脑缺血再灌注损伤后Caspase-9表达的影响，探讨其对脑缺血再灌注损伤的保护机制。

1 材料与方法

1.1 材料 成年清洁级雄性Wistar大鼠50只，体质量230～250 g，［青岛市实验动物和动物实验中心提供，许可证号:SCXK(鲁)20090007。兔抗鼠Caspase-9一抗(Abcam，美国);BMP-7(北京博奥森);免疫组化试剂盒(北京博奥森);SYBR Green Real-time PCR试剂盒和逆转录试剂盒(TAKARA，日本);BCA蛋白定量试剂盒(江苏碧云天);Trizol(Invitrogen，美国);Caspase-9引物由上海生工合成。

1.2 方法

1.2.1 模型制备 实验前将动物置于实验室适应环境1 w，自由进食、饮水，室温(23±2)℃，自然光照，术前禁食12 h。参考Longa等［6］方法，应用线栓法经左侧颈外-颈内动脉插线建立缺血2 h再灌注24 h模型。术中和术后用恒温电热毯保持动物肛温36℃～37℃。以大鼠术后麻醉清醒后出现左侧Honer征、提尾右侧上肢屈曲、爬行时向右侧转圈者为模型成功的标志，假手术组插线10 mm后即刻退出，其余操作同手术组。

1.2.2 动物分组和给药方法 将实验动物随机分为4组:假手术组、模型组、BMP-7低剂量组(0.1 mg/kg)、BMP-7 高剂量组(0.2 mg/kg)，每组10只。治疗组在缺血2 h后经尾静脉给予不同剂量BMP-7(250μl)，假手术组和模型组同步给予等体积的生理盐水。

1.2.3 神经功能评分 大鼠缺血再灌注后，按照Longa等［2］5分法，进行神经功能评分。0分:无明显神经功能缺失;1分:对侧前爪不能完全伸直;2分:行走时向对侧旋转;3分:行走时向对侧倾倒;4分:不能自发行走，意识丧失。

1.2.4 HE染色 缺血2 h再灌注24 h后，每组各取5只大鼠，用10%水合氯醛麻醉后打开腹腔后，依次用生理盐水、4%多聚甲醛灌注后，断头取脑，置于4%多聚甲醛固定。脑组织常规梯度乙醇脱水、二甲苯透明、石蜡包埋，自视交叉后连续冠状位切片，片厚5μm。切片常规脱蜡水化，蒸馏水冲洗后，行HE染色，光学显微镜下观察脑组织病理变化。

1.2.5 免疫组织化学染色 取上述石蜡切片，常规脱蜡水化，蒸馏水冲洗后，按照说明书进行Caspase-9免疫组织化学染色，光镜下观察胞质有棕色颗粒者为阳性细胞。部分切片不加一抗，用0.01 mmol/L PBS代替，作为阴性对照。每张切片在皮质区随机取5个不重叠的高倍镜视野(400×)，计数各视野阳性细胞数，取其均数。

1.2.6 实时定量RT-PCR检测 缺血2 h再灌注24 h后，每组各取5只大鼠，快速断头取脑分离皮质后置于-80℃冰箱中保存。取缺血侧皮质100 mg，用Trizol试剂盒说明进行总RNA的提取测定其纯度及浓度。将总RNA用逆转录试剂盒进行逆转录得到 cDNA。取1μl cDNA为模板，采用SYBR Green Real-time PCR试剂盒，在Bio-Rad iCycler iQ实时定量PCR仪上检测各组Caspase-9 mRNA含量。反应体系为20μl，反应条件如下:先95℃ 60 s，再95℃ 10 s，60℃ 30 s，循环反应40次。采用2-△△Ct法比较Caspase-9在各组中的表达差异。△△Ct=目的基因的CT平均值-内参基因的CT平均值。引物应用Primer Premier软件设计，引物序列为:Caspase-9上游引物5’-TCA CGG CTT TGA TGG AGA TG-3’，下游引物5’-AGA GAGGAT GAC CAC CAC GAA-3’;内参 GAPDH上游引物5’-GACAACTTTGGTATCGTGGAAGG-3’;下游引物 5’-CCA GTA GAG GCA GGG ATG ATG T-3’。

1.2.7 Western blot检测 取-80℃保存的缺血侧皮质100 mg，按1:4比例加入400μl预冷细胞裂解液中，充分研磨，4℃ 12000 r/min离心20 min，取上清液，采用BCA法进行蛋白定量，并将蛋白样品标准化。取30μg蛋白样品，用10%SDSPAGE电泳分离蛋白质，分离的蛋白质转移到硝酸纤维素膜上，用10%脱脂牛奶封闭1 h后加入兔抗鼠Caspase-9单克隆抗体(1:1000)，4℃孵育过夜。取出上述膜，TBST洗3次，每次15 min。在膜上加入生物素标记二抗后室温孵育1.5 h，TBST洗膜3次后用ECL化学发光法显色，曝光后保存图片，以β-actin为内参，应用Quantity One分析软件对蛋白条带进行灰度扫描。

1.2.8 统计学处理 采用 SPSS 17.0统计软件分析，数据以χ±s表示，多组数据采用单因素方差分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 神经功能行为评分 假手术组无神经功能缺损症状，其余各组大鼠出现不同程度的神经功能缺损。BMP-7中、高剂量组神经功能评分(1.6±0.5;1.4 ±0.5)与模型组(2.8 ±0.5)相比显著降低(t=3.79，t=4.43，P ＜0.01)。

2.2 大鼠梗死侧皮质病理学变化 假手术组大鼠皮质组织结构完整，胞浆、胞核结构清晰，神经细胞、胶质细胞和毛细血管形态及分布正常(见图1A)。模型组皮质神经细胞数量减少，胞浆、胞核界限不清，核固缩和核溶解，细胞明显肿胀坏死(见图1B)。与模型组相比，BMP-7治疗组神经细胞数量增多，细胞形态相对规则，核固缩和核溶解减轻，水肿减轻(见图1C)，且以BMP-7高剂量组改善最为明显(见图1D)。

2.3 大鼠梗死侧皮质活性Caspase-9表达 疫组织化学染色显示，假手术组大鼠皮质可观察到少量 Caspase-9 阳性细胞(1.4 ±1.1)，模型组 Caspase-9阳性细胞数(28.8±5.2)较假手术组显著增多(t=11.58，P ＜0.01)。与模型组相比，BMP-7 低、高剂量组Caspase-9阳性细胞数(18.8±3.3;13.2±3.7)显著减少(t=3.19，t=5.49;P ＜ 0.05，P ＜0.01)(见图2、图3)。

2.4 大鼠梗死侧皮质Caspase-9 mRNA的表达

实时定量RT-PCR扩增曲线显示，各组大鼠缺血侧皮质Caspase-9扩增良好。与模型组相比，BMP-7中、高剂量组 Caspase-9 mRNA 表达(2.33±0.29;1.85 ±0.32)显著减少(t=2.56，t=4.52;P ＜0.05，P ＜0.01)(见图4)。

2.5 大鼠梗死侧皮质活性Caspase-9蛋白的表达 Western blot检测显示，假手术组活性Caspase-9呈很低量表达，与模型组相比，BMP-7低、高剂量组活性Caspase-9蛋白表达平均灰度值显著降低(t=3.11，t=5.62;P ＜0.05，P ＜0.01)(见图5)。

图1 再灌注后大鼠脑组织病理改变(×200)

图2 各组大鼠缺血侧皮质Caspase-9阳性细胞(×400)

图3 各组大鼠缺血侧皮质Caspase-9阳性细胞计数

图4 BMP-7对大鼠缺血侧皮质Caspase-9 mRNA表达的影响

图5 BMP-7对大鼠缺血侧皮质Caspase-9蛋白表达的影响

3 讨论

Liu等［7］研究发现，大鼠脑缺血再灌注损伤后，BMP-7可增加缺血后脑组织葡萄糖的利用率和血流量。Chou等［8］观察到，BMP-7可促进梗死对侧脑室下区神经祖细胞的增殖，并促使其转移到梗死侧大脑皮质周围。本实验研究表明，脑缺血再灌注损伤后经尾静脉注射BMP-7可促进大鼠神经功能的恢复，病理组织学显示BMP-7可明显减轻大鼠脑缺血再灌后的脑损伤，维持在脑缺血状态下神经细胞的正常形态和功能，延缓其凋亡和坏死，尤其以BMP-7高剂量组的效果最为明显，说明BMP-7对脑缺血再灌注损伤有明显的神经保护作用。脑缺血再灌注后触发的一系列复杂的级联反应，包括氨基酸毒性、自由基生成、蛋白酶激活、炎症反应等，其最终阶段均涉及到Caspase介导的细胞凋亡［9～11］。脑缺血后神经细胞凋亡主要包括Caspase参与的线粒体凋亡途径和死亡受体凋亡途径，其中Caspase-9是线粒体凋亡途径的启动酶，当凋亡信号传至线粒体时，线粒体释放细胞色素C(CytC)，CytC与Procaspase-9及凋亡活化因子-1(Apaf-1)结合形成凋亡体，进而使Procaspase-9发生裂解成为活性 Caspase-9，活性Caspase-9又能进一步促进下游的Caspase的激活，引发DNA的断裂和多种蛋白成分的破坏，最终导致细胞凋亡［12］。朱炬等［13］发现大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤后Caspase-9 mRNA的表达增强。Mouw等［14］研究表明，大鼠脑缺血再灌注损伤后，脑组织活性 Caspase-9的表达明显增加，而特异性的Caspase-9抑制剂可下调活性Caspase-9的表达，抑制神经细胞凋亡，减小大鼠脑梗死体积。因此，通过拮抗Caspase-9的表达抑制细胞凋亡可对脑缺血再灌注损伤起保护作用。

本实验显示，大鼠缺血2 h再灌注24 h后，大鼠皮质区Caspase-9蛋白及Caspase-9 mRNA表达增强。BMP-7明显抑制了缺血再灌注诱导的皮质区Caspase-9蛋白及Caspase-9 mRNA的表达，并且以高剂量的BMP-7效果更加明显，提示BMP-7能够降低Caspase-9的表达与活化从而减少脑缺血损伤后神经元的凋亡。本课题组前期实验表明，BMP-7可下调脑组织中Caspase-3的表达，从而抑制脑缺血损伤导致的细胞凋亡［15］。因此，我们认为 BMP-7通过下调Caspase-9和Caspase-3表达，抑制线粒体凋亡途径，来减少神经元凋亡，进而对脑缺血再灌注损伤起保护作用。但有关 BMP-7对 Caspase-9和Caspase-3上游的信号通路的影响尚缺乏相关的研究，因此我们将进一步研究Caspase-9和Caspase-3上游的信号通路，阐明BMP-7抑制神经细胞凋亡的完整信号分子传导途径。

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