浸矿微生物与矿物相互作用的研究方法与技术

王乾芬， 李芊， 周双， 宋子博， 朱建裕

（中南大学资源加工与生物工程学院，长沙410083）

0 引 言

富矿资源由于不断地开发利用而日趋贫乏，高效合理地开发利用低品位难处理金属矿产资源已经成为热点.生物冶金由于低成本、低能耗、少污染成为了处理低品位矿物的有效方法[1-2].矿物生物浸出时，金属离子是在浸矿微生物-矿物相互作用过程中溶出的[3-4].因此，为了获得较高的金属浸出率，研究浸矿微生物-矿物相互作用显得尤为重要.

微生物与矿物表面的相互作用依赖于若干物理和生化参数.研究显示微生物通过各种方法吸附在矿物表面：黏液层的分泌，蛋白结合受体，化学吸附，静电、疏水性相互作用，使用多糖-蛋白质复合物或借助于菌毛吸附[5-8]，因此，微生物与矿物相互作用受两者表面性质的影响.对于微生物与矿物相互作用研究中表面性质的表征来说，确定微生物种类、矿物类型、溶液环境等都很重要[9-10].因而，通过各种方法来表征作用体系的性质，有助于加深对微生物与矿物相互作用的理解.微生物与矿物之间实验分不开的复杂的物理化学相互作用使两者之间相互作用的研究有一定难度.

随着研究的不断发展与深入，各种物理的、化学的方法以及仪器分析的技术逐步地应用于相互作用领域.目前，微生物与矿物相互作用既可以从宏观角度分析，也可以从分子或原子的微观角度来分析.微观和宏观层面分析的结合使相互作用机制的探讨更加深入，并将微生物与矿物相互作用的研究推向了新的高度.本文总结了浸矿微生物-矿物相互作用的主要研究方法和技术，以便使这些方法技术进一步从不同视角和尺度来研究生物冶金的机理与过程.

1 经典物理化学方法

浸矿微生物-矿物相互作用涉及到物理、化学等各方面的机理.定性定量描述微生物吸附到矿物表面的机理包括表面热力学方法、经典DLVO及扩展DLVO理论、等温吸附模型和微量热技术等.

1.1 表面热力学方法

热力学方法通过比较浸矿微生物与矿物相互作用前后界面自由能的变化来解释吸附[11-13]，吸附的总自由能表述为[13]：

其中，γsm，γsl和 γml分别为矿物与浸矿微生物，矿物与溶液及浸矿微生物与溶液的界面自由能.当△Gadh小于0，浸矿微生物容易吸附到矿物的表面.反之，则不易发生吸附.

GU Guo-hua等[14]应用热力学方法计算Acidithiobacillus ferrooxidans在黄铁矿表面吸附的自由能，发现其吸附自由能为正值，无法解释Acidithiobacillus ferrooxidans在黄铁矿表面的吸附现象.P.K.Sharma等[13]使用表面热力学方法来预测Paenibacillus polymyxa在黄铜矿和黄铁矿表面的吸附行为.热力学方法表明Paenibacillus polymyxa和2种矿物之间存在着范德华引力和酸碱作用斥力，细菌与矿物表面之间的吸附自由能都是正值，也就是说细菌不能吸附到矿物表面，但这与实验结果相反.A.Vilinska和 K.Hanumantha Rao[15]用表面热力学方法预测Leptospirillum ferrooxidans在黄铁矿和黄铜矿表面的吸附情况，结果表明细菌与2种矿物表面之间存在范德华引力和酸碱作用引力，两者之间的吸附自由能为负值，即Leptospirillum ferrooxidans可以吸附到黄铜矿或者黄铁矿表面.表面热力学方法是对假定为可逆吸附的平衡过程的一种描述，但是忽视了静电相互作用及吸附自由能和距离之间的关系.当微生物与矿物之间的酸碱作用为引力或者范德华引力大于酸碱作用斥力时，热力学方法预测微生物可以吸附到矿物表面.相反则不能.因此，表面热力学方法不能完全解释吸附动力学特征，甚至还会出现与细菌吸附的实际测定数据不相符的结果.

1.2 经典DLVO及扩展DLVO理论

经典DLVO理论包括范德华力和静电力[12－13，16]，相互作用的总能量（Gtotal）等于范德华力能（GLW）和静电力作用能（GEL）之和，即：Gtotal（H）=GLW（H）+GEL（H）.这里H为微生物与矿物表面的距离.范德华相互作用是浓缩状态下的分子或者表面的微小引力，它包括永久偶极子之间、永久偶极子与感生偶极子之间及感生偶极子之间的引力，它通过测定微生物及矿物的接触角来计算，因而，通过接触角数据可以直观地表现亲疏水性.静电作用是由于两界面之间的双电层相互作用产生的，Zeta电位是连续相与附着在分散粒子上的流体稳定层之间的电势差，它可以表征分散粒子在连续相中表面所带的电荷性质及电荷量，因此，测量Zeta电位在确定微生物与矿物之间的静电相互作用中变得很重要.DLVO理论的缺陷是，只考虑到微生物细胞与矿物表面间的长程范德华力势能和静电力势能的相互作用.实际上，二者间还存在诸如疏水力、氢键等作用力.后来，Van Oss等[12-13]将酸碱相互作用加入经典DLVO理论中.酸碱作用能（GAB）依赖于在溶液中极性部分的电子供体和电子受体之间的相互作用.因此，浸矿微生物与矿物之间的作用势能曲线被描述为范德华力、静电力和酸碱作用力关于作用距离（H）的一种平衡：Gtotal（H）=GLW（H）+GEL（H）+GAB（H）.

GU Guo-hua等[14]通过扩展DLVO理论建立的范德华力、疏水相互作用和静电作用自由能与作用距离（H）之间的势能曲线准确地预言了Acidithiobacillus ferrooxidans在黄铁矿表面的吸附现象.Mohsen F arahat等[17]利用扩展DLVO理论来评估Ferroplasma acidiphilum在黄铁矿表面的吸附情况，根据扩展DLVO理论，在研究的所有pH条件下，细菌矿物总的相互作用能主要由静电能贡献，其次是酸碱相互作用能和范德华能.酸碱相互作用比静电相互作用和范德华相互作用影响大，但是酸碱相互作用是短程的，相互作用面必须足够近.扩展DLVO理论可以解释所有pH条件下Ferroplasma acidiphilum-黄铁矿的吸附行为.

1.3 等温吸附模型

吸附等温曲线是指在一定温度下微生物在矿物表面的吸附达到平衡时，微生物在两相中浓度之间的关系曲线.根据吸附实验获取的数据，拟合它们间的关系，其拟合参数能概括吸附量、吸附强度和吸附状态等特性.Langmuir方程和Freundlich方程己经广泛应用于浸矿微生物吸附到矿物表面的模拟中，且能很好地拟合浸矿微生物在矿物表面吸附的实验数据[18-19].Langmuir方程用于微生物-矿物吸附必须提出假设：吸附必须是单层的，均匀的，且吸附的细胞之间无相互作用.Freundlich方程用于微生物-矿物吸附时不容易区分是单层吸附还是多层吸附，主要看细菌在矿物表面的覆盖度.LeXian Xia等[20]测定了Acidithiobacillus ferrooxidans ATCC 23270吸附到黄铜矿上的数量，并且利用Langmuir和Freundlich方程对吸附数据进行了模拟.2个方程模拟的相关系数都超过了0.9，说明细菌吸附到矿物表面是一个涉及到Langmuir和Freundlich特性的很复杂的过程.S.N.Tan等[21]观察了Acidithiobacillus ferrooxidans吸附到黄铜矿以及黄铁矿表面的行为，并对吸附数据进行了假一级动力学和Langmuir方程的模拟，实验结果表明细菌吸附受底物疏水性质的影响，由调节趋化性的化学感应系统控制的Acidithiobacillus ferrooxidans的活性位点，来应对细菌-矿物的初始接触.

1.4 微量热技术

等温滴定微量热法是微量热测定方法中较常用的一种.等温滴定微量热法通过高灵敏度、高自动化的微量量热仪连续准确地监测和记录量热变化[22-23].Xingmin Rong等[24]利用等温滴定微量热仪（ITC）和傅立叶红外光谱仪（FTIR）鉴定Pseudomonas putida在针铁矿上的吸附，在pH低于针铁矿等电点时，大量的细菌吸附到针铁矿上.ITC的实验结果表明细菌吸附到针铁矿上是放热反应，吸附焓随着pH和电解质浓度的提高而提高.等温滴定微量热法通过自动记录反应的热功率（P）随时间（t）变化的曲线[25-26]，对 P-t曲线与基线之间的峰面积进行积分，就得到反应焓变（△H），进一步可以求出一系列反应动力学参数，如熵变、自由能变等，并且还可以获得反应的结合位点数.等温滴定微量热法既可以研究液相、固相、气相反应及两相间的反应，也可以长时间地监测缓慢的反应过程.Thore Rohwerder等[27]用等温滴定微量热法，分批测定化能无机营养型的浸矿细菌Acidithiobacillus ferrooxidans单菌，Leptospirillum ferrooxidans单菌及Leptospirillum ferrooxidans和Acidithiobacillus thiooxidans混菌分别氧化黄铁矿的反应能.实验表明，对比Acidithiobacillus ferrooxidans单菌或者Acidithiobacillus thiooxidans 单菌，Leptospirillum ferrooxidans具有更高的能量储存效率，利用等温滴定微量热测定方法，可以定量矿物的浸出速率.朱建裕等[28]以细菌胞外聚合物的3种模拟成分葡萄糖、甘露糖和半胱氨酸与黄铁矿相互作用，通过等温滴定微量热技术，考察了它们与黄铁矿表面相互作用的反应热情况，半胱氨酸与黄铁矿的吸附和气体-固体吸附过程相似，符合langmuir单层吸附模型，而葡萄糖和甘露糖为多层吸附.实验结果证明胞外聚合物（EPS）介导细菌吸附到硫化矿上，并与其发生反应导致矿物表面化学成分的改变.

2 表面成分检测方法

2.1 X射线衍射法（X-ray diffraction，XRD）

X射线衍射仪能够定性定量分析大部分金属和非金属粉末样品[29-30]，具有测量精确和样品制备简单等特点.夏乐先等[31]利用X射线衍射和扫描电子显微镜/能谱（SEM/EDX）来分析 Acidithiobacillus ferriooxidans与Acidithiobacillus thiooxidans分别及共同浸出闪锌矿.XRD确定了太高的三价铁离子由于形成黄钾铁矾而降低了锌离子的溶解.另外，通过XRD、SEM和EDX分析无菌条件下，或者只有Acidithiobacillus ferriooxidans条件下，浸出闪锌矿的残基，表明存在于矿渣表面的硫层阻碍了矿物的浸出，Acidithiobacillus thiooxidans浸出的矿渣表面没有硫层.2种细菌在共同浸出闪锌矿过程中展现了不同的功能.Hui Liu等[32]通过XRD和FTIR分析Acidithiobacillus ferrooxidans与黄铁矿相互作用30 d后的矿渣表明黄钾铁矾的形成及无硫层的存在，这说明此种浸出情况下，阻碍矿物浸出的是黄钾铁矾钝化层.

2.2 傅立叶变换红外光谱法 （Fourier transform infrared spectroscopy，FTIR）

傅立叶变换红外光谱仪能够定性定量分析样品，可以分析样品表面的官能团，具有分辨率高、重现性好、测定光谱范围宽等优点[33-35].Santhiy等[36]用FTIR分析发现Acidithiobacillus ferrooxidans吸附在方铅矿及闪锌矿表面时，3383cm-1的吸收峰和1 453cm-1的吸收峰因为吸附过程中氢键的作用发生偏移.Mengxue Diao等[37]结合FTIR与SEM分析证明细菌Acidithiobacillus thiooxidans和Leptospirillum ferrooxidans表面成分及表面附属物的不同，导致了在AFM测量细菌与黄铁矿相互作用过程中缩回曲线的差异.CHEN Ming-lian等[38]通过FTIR分析Acidithiobacillus ferrooxidans和Acidithiobacillus caldus分别与黄铜矿相互作用后的样品，与Acidithiobacillus ferrooxidans相互作用后的黄铜矿比与Acidithiobacillus caldus相互作用后的黄铜矿变化明显，将这2种样品与纯黄铜矿样品的红外光谱进行比较得知：细胞吸附到了黄铜矿表面，结合吸附试验，Acidithiobacillus ferrooxidans比Acidithiobacillus caldus吸附到黄铜矿表面的量多.

2.3 拉曼光谱法（Raman spectra）

拉曼光谱仪可用于分子结构研究的分析，它能提供简单快速、可重复、无损伤的定性定量分析，无需样品准备[39-41].R.H.Lara等[42]使用拉曼光谱来分析评估在黄铁矿电极表面的硫化合物的状态，被Acidithiobacillus thiooxidans氧化的矿物颗粒样品的拉曼光谱，证实了在酸性条件下黄铁矿的腐蚀过程中元素硫的形成、稳定和渐进式的结晶.P.K.Sharma等[43]利用FTIR和拉曼光谱，揭示了硫或黄铁矿培养的Acidithiobacillus ferrooxidans菌比硫酸亚铁培养的Acidithiobacillus ferrooxidans菌的表面蛋白含量更高，这表明在不同的生长条件下细菌合成蛋白成分的差异，导致了细菌表面电荷的不同.

2.4 X-射线光电子能谱法 （X-ray photoelectron spectroscopy，XPS）

X射线光电子能谱，根据光电子的结合能定性定量分析物质的元素种类及化学形态[44-47]，在研究微生物对矿物的溶解过程中起到独特的作用.Åke Sandström等[48]结合 XRD和 XPS来研究65℃的 2个不同的还原电位条件下，极端嗜热微生物Sulfolobus metallicus浸出及化学浸出黄铜矿所得的矿渣，在这2种情况下黄铜矿的浸出，均比在较低的氧化还原电位时有较大地提高，这也导致了大量元素硫的形成，但是在化学浸出时提高的特别明显.高的氧化还原电位伴随着黄钾铁矾的生成，而生物浸出可以将硫完全氧化成硫酸.因此，黄铜矿浸出的钝化层是黄钾铁矾.Keiko Sasaki等[49]利用XPS分析有无CE透析膜存在时，Acidithiobacillus caldus与黄铜矿相互作用过程中硫的形成和消失，实验表明2种情况下黄铜矿表面均形成了一硫化合物和元素硫，并且细菌直接与矿物接触更有助于中间化合物的溶解和铜的浸出.

2.5 X-射线吸收近边结构光谱法（X-ray absorption near-edge structure spectroscopy，XANES）

X-射线吸收近边结构光谱能，能够获得吸收X射线的原子周围的配位原子种类、键长、配位数等电子和几何的局部结构参数[50-52]，该技术具有可进行元素分辨，对吸收原子的周围局域结构和化学环境敏感等优势.Huan He等[53]结合 XANES、SEM 和 XRD来研究极端嗜热微生物Acidianus manzaensis与黄铜矿相互作用过程中硫形态的变化.SEM表明细胞吸附到黄铜矿上，相互作用20d后矿物表面被许多絮状物覆盖.XRD指出矿渣主要成分是黄铜矿和黄钾铁矾，同时XANES证明Acidianus manzaensis与黄铜矿相互作用的钝化层主要是黄钾铁矾.光谱形貌分析表明：铜蓝是黄铜矿生物浸出过程中的中间硫化合物.

3 微观形貌探测技术

3.1 电子显微镜技术（Electron microscope，EM）

电子显微镜采用电子束和电磁透镜来成像，从而使其分辨率提高至在1 nm下观察样品[54-55]，EM在浸矿微生物-矿物相互作用的研究中应用较早.D.Mikkelsen等[56]通过扫描电子电镜（SEM）和透射电子显微镜（TEM）观测极端嗜热微生物Acidianus brierleyi，Metallosphaera sedula 和 Sulfolobus metallicus与黄铁矿之间的相互作用.随着黄铁矿的分解，沉积结构继续形成，从亚微米的沉淀物到圆片形的结构分布于矿物表面.曾伟民等[57]利用扫描电子显微镜/能谱（SEM/EDX）分析中度嗜热细菌浸出黄铜矿电极，结果表明黄铜矿表面覆盖有EPS和黄钾铁矾，证明了这些物质是阻碍铜连续浸出的钝化层的主要成分.Hui Liu等[32]利用SEM分析了Acidithiobacillus ferrooxidans与黄铁矿相互作用30 d后的矿渣，结果在矿物表面有圆形的、方形的和瘦长形的腐蚀坑的存在，这些腐蚀坑的分布正好与不同的晶面相关，并且所有坑的大小都比不上细菌的大小.

3.2 原子力显微镜技术（Atomic force microscope，AFM）

原子力显微镜是研究微生物与矿物之间相互作用的有力工具，它不仅能够获取单细胞在固相表面的吸附等高分辨率的图像，而且可以在纳米距离范围内，测定微生物与矿物之间相互作用力随距离的变化[58-60]，具有原子级的分辨率.Jianyu Zhu等[61]利用AFM探测Acidithiobacillus ferrooxidans， Acidithiobacillus thiooxidans及Leptospirillum ferrooxidans分别与黄铜矿之间的相互作用力，结果表明细菌细胞的表面电荷和疏水性质都影响细菌的吸附力，且EPS缺损时吸附力减小，这说明EPS对细菌-矿物相互作用是十分重要的.Weimin Zeng等[62]利用AFM观测吸附到矿物表面的中度嗜热微生物Acidithiobacillus caldus快速地产生EPS，并且EPS一旦产生就很难减少或消除，这样在浸矿后期大量的EPS介入导致黄钾铁矾生成，阻碍了铜的继续浸出.K.Kinzler等[3]通过AFM来观察 Acidithiobacillus ferrooxidans R1，R7，C-52 和SPIII/3四株菌对黄铁矿的吸附情况，实验数据表明在EPS中具有更高三价铁离子的菌株展现较好的吸附情况和氧化活性.

3.3 荧光显微镜技术（Epifluorescencemicroscopy，EFM）

荧光显微镜用紫外线使被检测物体发出荧光，它能够对物体的形状及位置进行观察，与原子力显微镜相结合来做定性定量的研究.N.Noël等[63]靠原子力显微镜和荧光显微镜的DAPI染色和 FISH探针，来揭示了吸附到黄铁矿样品表面的细菌种类（Acidithiobacillus ferrooxidans，Acidithiobacillus thiooxidans， Acidithiobacillus caldus， Leptospirillum ferrooxidans和 Leptospirillum ferriphilum），微生物可以被详细地鉴定至某一特定的种.Leptospirillum ferriphilum引起了聚合，并且提高了细胞吸附到黄铁矿样品表面的量.Acidithiobacillus caldus单独不能吸附到黄铁矿表面，Leptospirillum ferriphilum和Acidithiobacillus caldus混菌吸附试验，证明Leptospirillum ferriphilum先吸附到矿物表面才能使Acidithiobacillus caldus发生吸附，在这种情况下，Leptospirillum ferriphilum是生物膜形成的关键微生物.Stefanie Mangold等[64]利用AFM和EFM来研究吸附的Acidithiobacillus ferrooxidans细菌及EPS与矿物之间的相互作用.AFM成像提供了细胞的空间排列和物质从溶液到单细胞之间转换的痕迹.EFM鉴定了生物膜的组分及其分布状态.AFM与EFM相结合有助于我们进一步丰富微生物-矿物界面作用的相关知识.

3.4 激光扫描共聚焦显微镜技术（Confocal laser scanning microscope，CLSM）

激光扫描共聚焦显微镜逐点、逐行、逐面的快速扫描成像，经过各种特异性的荧光染色，CLSM能够排除非焦平面信息以直观反应立体空间分布、无损深层形态结构地观察细胞的形态，及提高分辨率和对比度以定量分析细胞内生化成分等[65-66].Sören Bellenberg等[67]利用CLSM观测Acidithiobacillus ferrooxidans ATCC 23270的荚膜多糖，实验表明细菌与金属硫化物降解产物接触等多方面的影响，诱导了细菌荚膜多糖的产生.Cindy-Jade Africa等[68]结合原子力显微镜、荧光显微镜和激光扫描共聚焦显微镜，来鉴定Metallosphaera hakonensis分别吸附到黄铜矿和黄铁矿样本表面及细菌在矿物表面形成的生物膜，矿物表面的细菌覆盖率与温度和时间相关，细菌在金属硫化矿的优先吸附和生物膜形成也被观察到.同时原子力显微镜和荧光显微镜的结合，提高了对微生物与矿物位点特异性结合的评估.B.Florian等[69]利用AFM、EFM和CLSM观测微生物与黄铁矿之间的相互作用，在吸附实验中，矿物表面某些地方细菌成簇的吸附，但是有的地方没有细菌吸附，不同菌种的细菌在矿物表面的分布和空间排布有较大差别，这些实验结果有助于进一步研究细菌与矿物之间的特异性相互作用.

4 结束语

综上所述，经典物理化学分析方法是研究浸矿微生物-矿物相互作用基础而重要的研究手段.从物理化学的角度分析浸矿微生物与矿物的相互作用，考虑两者的静电相互作用、范德华力和疏水作用等，反应过程中的自由能和热量变化，但是只通过这些分析方法很难获取浸矿微生物-矿物相互作用的微观信息.表面成分分析方法和微观表面探测技术，已应用于浸矿微生物和矿物相互作用的机理研究中，如荧光显微镜、X射线光电子能谱以及X-射线吸收近边结构光谱等技术，以上手段从微观的角度，揭示了浸矿微生物与矿物相互作用前后形貌的变化和相互作用的基团或化学键等信息.经典物理化学分析技术、表面成分分析方法及微观表面探测技术相结合，在浸矿微生物与矿物相互作用研究中使我们更加了解浸矿微生物与矿物相互作用的机理，为进一步提高生物浸出效率和控制酸性矿坑水的污染提供了有效的信息.

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