红细胞洗涤前后血红蛋白电泳结果的比较

刘发生，夏志杨，盛翔，周灿邦

(东莞仁康医院检验科，广东 东莞523952)

电泳分析是研究和分离异常血红蛋白的有效方法，是诊断血红蛋白分子病不可缺少的手段。血红蛋白电泳作为地中海贫血筛查项目，在日常工作中标本多，而红细胞洗涤为手工操作，不仅工作量大，而且产生大量需要消毒的实验废液。为了减轻工作量，我们以洗涤前后的红细胞分别制备血红蛋白液，同时进行血红蛋白电泳；还以血浆代替红细胞加等量溶血剂后在血红蛋白电泳凝胶上电泳，观察是否出现电泳区带，现报告如下。

1 材料与方法

1.1 标本来源 收集本院2013年1月11日至2013年3月16日期间，地中海贫血筛查乙二胺四乙酸二钾抗凝血标本259份，其中静脉血121份(男性10人，年龄14～43岁，平均31.6岁；女性111人，年龄16～82岁，平均27.4岁)，脐带血 138份。收集乙二胺四乙酸二钾抗凝的无溶血血浆26份，其中静脉血浆13份(总蛋白59.9～93.9g/L、白蛋白33.5～58.2g/L、 球蛋白 25.8～65.0g/L)， 脐带血浆 13份(总蛋白 48.1～64.8g/L、白蛋白 27.3～38.7g/L、球蛋白13.3～31.7g/L)。不能当天电泳的标本置4℃冰箱冷藏保存，时间不超过1周。

1.2 仪器与试剂 Interlab G26全自动蛋白质电泳仪，由意大利Interlab公司生产，使用该公司配套生产的碱性血红蛋白凝胶电泳试剂盒604K。严格按仪器和试剂说明书操作。

1.3 方法

1.3.1 洗涤前红细胞血红蛋白电泳 抗凝血标本经3500r/min 10min后，倾去血浆和上层红细胞，留取管底层红细胞，吸取管底层红细胞50μl，加入450μl溶血剂中，混匀，静置5min后加样上机进行血红蛋白电泳。

1.3.2 洗涤后红细胞血红蛋白电泳 将上述管底层红细胞加2 ml生理盐水，混匀后3500r/min 5min，吸去上清液后再加2 ml生理盐水，如此洗3次。吸取管底层红细胞50μl，加入450μl溶血剂中，混匀，静置5min后加样上机进行血红蛋白电泳。

1.3.3 血浆代替红细胞电泳 取血浆50μl，加入450μl溶血剂中，混匀，静置5min后加样上机在血红蛋白琼脂糖凝胶上电泳。

1.4 统计学方法 以SPSS 15.0软件进行配对t检验，P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 121份静脉血标本血红蛋白电泳结果 (1)红细胞洗涤前后电泳图目视检查，区带数和位置完全一致，HbA与HbA2光度密扫描结果的统计学分析见表1；配对t检验，P均＞0.05，说明静脉血红细胞洗涤前后电泳结果的差异没有统计学意义。(2)有3份标本红细胞洗涤前检出HbF(分别为1.0%、0.4%、0.7%)，而洗涤后HbF均为0；另有1份标本洗涤前HbF 9.8%，洗涤后HbF 9.4%。也即，少数静脉血标本未洗涤红细胞对HbF结果可能有一定影响(≤1.0%)，但不影响结果的定性判断。(3)有1份标本检出“快泳带”，洗涤前42.6%，洗涤后41.3%。

表1 121份静脉血红细胞洗涤前后血红蛋白电泳结果

2.2 184份脐带血标本血红蛋白电泳结果 (1)红细胞洗涤前后电泳图目视检查，区带数和位置完全一致，HbA与HbF光度密扫描结果的统计学分析见表2；(2)有17份标本洗涤前和/或洗涤后检出HbA2，结果统计分析见表3；(3)有11份标本检出“快泳带”，结果统计分析见表4。可见，无论是HbA、HbF，还是 HbA2或者“快泳带”的配对 t检验，P＞0.05，说明脐带血红细胞洗涤前后电泳结果的差异没有统计学意义。

表2 184份脐带血红细胞洗涤前后血红蛋白电泳结果

表3 17份脐带血检出HbA2情况

表4 11份脐带血检出快泳带情况

2.3 血浆代替红细胞电泳结果13份成人血浆和13份脐带血浆电泳图目视检查，在扫描区域内均未发现任何区带，只在阳极海绵条位置有一染色区带。可见，稀释10倍的血浆在血红蛋白电泳条件下的电泳图于扫描区域内不会呈现区带。

2.4 部分标本红细胞洗涤前后的血红蛋白电泳图与血浆代替红细胞的电泳图 见图1。

图1 部分标本红细胞洗涤前后的血红蛋白电泳图与血浆代替红细胞的电泳图

3 讨论

地中海贫血的诊断遵循由筛查试验(血液学表型分析)到确诊试验(基因型分析)的流程。目前一般把全血细胞计数、血红蛋白电泳作为地中海贫血的初筛指标[1]。与红细胞参数、渗透脆性等地贫筛查方法相比，血红蛋白电泳不仅可以检测HbA、HbF及HhA2含量，将地中海贫血初步分类为α地贫或β地贫，还可筛查出各种异常血红蛋白，如HbBatr`s、HbH、HbE、HbJ、HbG、HbD、HbK、HbCS等，有助于临床确诊，为进一步进行基因诊断和遗传咨询提供基础[2，3]。

琼脂糖凝胶结构均匀，含水量大，近似自由电泳，且对样品吸附极微。因此，电泳图谱清晰，分辨率高，重复性好[4]。全自动琼脂糖凝胶电泳具有能严格控制电泳条件，自动扫描定量，避免人工操作带来的技术误差，保证各区带定量的准确性，图谱可长期保存等优点，目前被很多医院用于地中海贫血的筛查，但有报道，其对部分HbH及HbBatr`s区带不能准确检出[5]。

血红蛋白液的制备方法有四氯化碳法、氯仿法、蒸馏水法等。四氯化碳法制备的血红蛋白液清晰、稳定，但毒性较大。氯仿虽然毒性较小，但能沉淀不稳定血红蛋白而不能用于不稳定血红蛋白的检查。蒸馏水法简便易行，为多数全自动电泳仪试剂盒所采用，本研究用试剂盒也为蒸馏水法，但因未除去膜蛋白，判断结果时应注意，且制成的血红蛋白液不能保存[6]，还有报道，蒸馏水法对异常血红蛋白的检出率不如四氯化碳法[7]。

为了避免血浆蛋白对血红蛋白电泳结果的影响，一般都要对红细胞进行洗涤。但是，红细胞洗涤为手工劳动，操作繁琐，费时费力，而且产生大量需要消毒处理的废液。本研究结果表明：即使以血浆代替红细胞进行电泳，在实验条件下也不会出现电泳区带。因为血红蛋白电泳时间较血清蛋白电泳时间长，血浆蛋白都“跑”过了血红蛋白电泳图的扫描区域。而且，离心后管底红细胞层中血浆量很少，其点样液中的血浆蛋白组分浓度达不到琼脂糖凝胶电泳的检测限(0.54g/L)[8]，因而在血红蛋白电泳图扫描区域内看不到血浆蛋白区带，红细胞洗涤前后血红蛋白电泳各区带扫描结果的差异也没有统计学意义。因此，我们认为全血3500r/min 10min离心后管底红细胞无需洗涤，可直接制备血红蛋白液用于Interlab G26琼脂糖凝胶电泳。

尽管未洗涤红细胞与洗涤红细胞的血红蛋白电泳结果定性判断一致，但少数静脉血标本未洗涤红细胞对HbF结果可能有一定影响，是否有某些特殊病例的血浆成分会出现异常区带或与血红蛋白区带重叠，有待进一步观察。因此，对于出现存疑区带的标本，或临床与其他实验提示可能有异常血红蛋白的标本，应当在洗涤红细胞后，以四氯化碳法制备血红蛋白液进行电泳复检。

[1]高丽韶,王莹,张翠梅.认识地中海贫血(上)[M].广州：广东人民出版社,2010:99-100.

[2]陈忠领,魏新燕,范关珍,等.911例血红蛋白电泳结果分析[J].实用医技杂志,2006,13(16):2806-2807.

[3]梁廷中.全自动血红蛋白电泳在地中海贫血筛查中的作用[J].实验与检验医学,2011,29(4):417-418.

[4]康熙雄.临床电泳[M].北京:人民卫生出版社,2006:29-30.

[5]陈永秀,周云珍,陈锦宏,等.两种电泳方法血红蛋白分析一致性的比较[J].检验医学，2013,28(3):229-232.

[6]叶应妩,王毓三,申子瑜.全国临床检验操作规程[M].第3版.南京:东南大学出版社,2006:180.

[7]刘庆峰,何雅军,黎庆梅,等.两种不同溶血方法对Hb电泳分辨率的影响[J].临床医学工程,2010,17(1):37-38.

[8]Interlab Srl.Alkaline Hemoglobin Electrophoresis procedure for Microgel and Interlab G26[EB/CD].Roma:Interlab Srl,2008,10:9.