微小RNA-7对人视网膜色素上皮细胞增生和迁移的影响△

李林 徐剑容 王咏针 孙玉莹 李斌

人视网膜色素上皮(human retinal pigment epithelium，hRPE)细胞是人类视网膜内的重要细胞，在维持光感受器细胞正常的代谢和功能中起关键作用。但在一些病理条件下，hRPE细胞异常增生是导致人类眼部疾病的主要原因，如增生性玻璃体视网膜病变(proliferative vitreoretinopathy，PVR)、增生型糖尿病视网膜病变(proliferative diabetic retinopathy，PDR)、脉络膜新生血管、息肉样脉络膜血管病变、年龄相关性黄斑变性等。国内外许多研究已经证实多种生长因子，如血小板生长因子、碱性成纤维细胞生长因子、血管内皮细胞生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)、肝素结合生长因子、转化生长因子、肿瘤坏死因子、胰岛素样生长因子(insulin growth factor，IGF)等，均在 PDR、PVR 等眼部增生性疾病的形成中起重要作用［1］，这些作用主要是通过刺激hRPE细胞增生、黏附和迁移来实现的。在这些反应过程中，细胞外信号调节激酶(extracellular signal-regulated kinases，ERK)1/2信号通路处于高度激活状态，阻断ERK1/2信号通路可以抑制hRPE细胞的增生和迁移。表皮生长因子(epidermal growth factor，EGF)与hRPE细胞上的 EGF受体(EGFR)结合就可以激活ERK1/2信号通路，引起细胞增生和迁移，参与眼病的发生。以往的针对其他种类的体细胞研究发现，微小 RNA-7(miRNA-7)对 ERK1/2的激活有抑制作用。所以，我们不禁联想miRNA-7对hRPE可能有相似作用从而抑制PVR的形成。本文在以往工作的基础上，拟通过研究 miRNA-7对体外培养的hRPE细胞 EGFR表达、ERK1/2信号通路、增生、迁移和凋亡的影响，深入研究 miRNA-7在PVR等疾病形成中所起到的作用，并尽可能考察其在临床治疗中的应用前景。

1 材料与方法

1.1 hRPE细胞的培养及鉴定 hRPE细胞取自健康成年角膜移植的供体眼，于死亡12 h内进行分离培养。在无菌状态下，弃除眼前段及玻璃体，自视盘处分离并去除视网膜神经层，形成眼杯。D-hank液冲洗眼杯2次。12.5 g·L－1胰蛋白酶(美国 Sigma公司)37℃下消化45 min。吸除消化液，加入含体积分数20%小牛血清(美国 Gibco公司)、青霉素(100 U·L－1)及链霉素(100 U·L－1)的改良 Eagle培养液(DMEM，美国Gibco公司)。经反复轻轻吹打及冲洗后，将冲洗液移入离心管中，1 000 r·min－1离心10 min，共2次。hRPE细胞以50×103个·mL－1的密度接种于含体积分数 20%小牛血清DMEM培养液的培养瓶中，在含体积分数5%CO2、湿度为90%的37℃细胞培养箱中培养。3～4 d更换1次培养液，直至细胞融合传代。

选第3～6代细胞用于实验，细胞爬片，采用链霉亲合素生物素化过氧化物酶复合物(SABC)法(武汉博士德公司试剂盒)进行细胞鉴定，一抗为鼠抗人细胞角蛋白单克隆抗体(pan-ck，Santa Cruz公司)。

1.2 miRNA-7合成及转染

1.2.1 合成 根据miRNA-7序列，由广州锐博生物科技有限公司合成miRNA-7和阴性microRNA前体(产品号分别为PM10047、AM17110)。

1.2.2 转染

1.2.2.1 转染效率 采用购自广州锐博的绿色荧光蛋白(GFP)荧光标记的miRNA-7前体，用无菌去离子水将 miRNA-7前体稀释为20 mmol·L－1。采用Lipofectamine 2000转染试剂(Invitrogen)。将常规条件下培养的hRPE细胞离心，去上清，用不含血清和双抗的DMEM培养液重悬，调整细胞密度为3 ×106个·mL－1，接种于 6 孔板，每孔 1.5 mL。转染过程如下:全程避光，将稀释过的miRNA-7前体溶液 2.5 μL、5 μL、10 μL 分别与 250 μL OPTIM-MEM 1混匀为 A液，将 5 μL脂质体与 250 μL OPTIMMEM 1混匀为B液，室温下静置5 min;将A液与B液混合，室温下静置20 min;将混合液轻轻加入孔中，混匀;常规条件培养24 h，PBS洗涤2次，荧光显微镜下观察，摄影。

1.2.2.2 转染及实验分组 将常规条件下培养的hRPE去上清，用不含血清和双抗的DMEM培养液重悬，调整细胞密度为3×106个·mL－1，接种于细胞培养板(蛋白和RNA检测采用6孔板，细胞增殖实验采用96孔板，其他实验采用24孔板)，根据前期转染优化结果，每孔加入miRNA-7前体和转染试剂，使 miRNA-7前体的终浓度为 50 nmol·mL－1，脂质体的终浓度为 2.5 μg·mL－1。转染 48 h 后，进行下一步检测。实验分为4组:miRNA-145干预组即miRNA-7前体干预组、阴性 miRNA对照组、空脂质体组、空白对照组。

1.2.2.3 Real-Time PCR 检测成熟 miRNA-7 的表达 收集各组细胞，用Trizol RNA抽提试剂(美国Invitrogen公司)提取细胞总RNA，－20℃保存备用。逆转录反应按试剂盒(美国Fermentas公司)说明进行，miRNA 反转录引物(cat.4366596)，miRNA-7PCR引物 (cat.4373145)，内 参 U6 PCR 引 物 (cat.4373381)均由广州锐博生物科技有限公司合成。使用美国ABI公司 SYBR Green PCR Master Mix试剂盒，按照试剂说明书配制20 μL反应体系:cDNA 1 μL，2 × POWER SYBRGreen PCR Master Mix 10 μL，上下游引物各4 μL，无核酸水1 μL。加入八连管后，上ABI 7500型荧光定量PCR仪，进行PCR扩增和检测，反应条件如下:50℃ 2 min;95℃ 10 min;95℃ 30 s、60 ℃ 1 min、72 ℃ 15 s，40 个循环;在 60 ℃收集荧光信号;循环结束后65～95℃绘制溶解曲线。每个样本检测均重复3次，相对定量采用比较Ct法:U6 作为内参照，ΔCt=CtmiRNA-7－CtU6，ΔΔCt=ΔCt实验组－ΔCt对照组，根据公式可以计算出各实验组中miRNA-7基因表达情况，即实验组miRNA-7基因表达倍数(Fold)=2－ΔΔCt。

1.3 细胞增殖和迁移

1.3.1 CCK-8检测细胞增殖抑制 转染后48 h，每孔加入CCK-8溶液10 μL(中国碧云天生物科技研究所)，常规条件下孵育 60 min，酶标仪(美国 Bio-Tek公司)检测450 nm波长处每孔的吸光度值(A值)，按照公式计算细胞增殖抑制率(cells inhibitor，CI)，即 CI=1－(处理组平均 A值/空白组平均 A值)×100%。

1.3.2 细胞迁移实验 用直径为8.5 mm的Boyden小室进行细胞迁移能力的检测。实验分组同1.2.2.2，常规培养24 h后，分别取4组细胞，用 DMEM/F12培养基洗涤后将密度调整为106个·mL－1，在趋化小室的下层加入含体积分数10%FBS的DMEM/F12培养基，然后盖上8 μm的微孔多聚碳酸酯滤膜。在趋化小室的上层分别加入已经制备好的800 μL细胞悬液，于常规条件下继续培养5 h。此后拆卸装置，用棉签擦去多聚碳酸酯滤膜上层的细胞，然后用甲醛固定，苏木精染色，在400倍光学显微镜下每张膜随机观察5个视野并计数，实验重复3次。每组迁移细胞数为15个视野的平均细胞数。

1.4 统计学方法 应用 SPSS 13.0统计软件，计量资料以表示，两组间miRNA-7转染率采用 t检验，计数资料之间比较采用 χ2检验，以 P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 细胞培养和鉴定 消化下来的hRPE细胞呈圆形，大小相似，富含黑色素颗粒，细胞结构不清。接种入培养瓶中2－4 d后，细胞贴壁变扁平，呈多边形;细胞伸出伪足，呈集落样生长。14－28 d细胞铺满培养瓶瓶底，致密排列，呈六边形或多边形。随着传代的进行，细胞内的黑色素颗粒逐渐减少，到第4代后，细胞内的色素颗粒基本消失，细胞呈梭形或不规则形，向成纤维细胞形态转变。抗角蛋白染色后，细胞胞浆呈棕黄色，可见典型的角蛋白中间丝网架。

2.2 miRNA-7合成及转染

2.2.1 化学合成miRNA-7前体可以成功转染hRPE细胞 采用Lipofectamine 2000转染试剂，以GFP为荧光标记物，转染后24 h观察，转染成功细胞的胞膜和胞浆中可见绿色荧光。当miRNA-7前体的终浓度为 50 nmol·mL－1、脂质体的终浓度为 2.5 μg·mL－1时，转染效率最高，达到80%以上(图1)。

Figure 1 Chemical synthesis precursor microRNA-7 can be transfected into hRPE cells successfully，staining with green fluorescent(200) 化学合成的miRNA-7前体可以成功转染hRPE细胞，显示绿色荧光(×200)

2.2.2 miRNA-7前体转染hRPE细胞后成熟 miRNA-7的表达情况 miRNA-7前体干预组每高倍视野下成熟 miRNA-7数为(56.06±3.45)个，与空白对照组的(1.00±0.03)个、空脂质体组的(0.96±0.02)个和阴性 miRNA 对照组的(1.02±0.04)个相比，差异均具有统计学意义(均为P＜0.05);空脂质体组、阴性对照组与空白对照组之间差异均无统计学意义(均为 P ＞0.05)。

2.3 miRNA-7对hRPE细胞增殖的影响 与空白对照组、空脂质体组及阴性 miRNA对照组比较，miRNA-7对hRPE细胞增殖有明显抑制作用。miRNA-7前体干预组细胞增殖抑制率(23.58%)明显高于阴性 miRNA对照组(2.35%)、空脂质体组(2.97%)与空白对照组(0%)，差异均具有统计学意义(均为P＜0.05)，空脂质体组、阴性 miRNA对照组与空白对照组之间差异均无统计学意义(均为P ＞0.05)。

2.4 miRNA-7对hRPE细胞迁移的影响 miRNA-7可抑制 hRPE细胞的迁移。细胞诱导5 h后，在miRNA-7前体干预组中，迁移细胞数明显较少，每高倍视野为(16.0±3.8)个;而在阴性 miRNA对照组、空脂质体组和空白对照组中，迁移细胞数明显较多，每高倍视野分别为(32.2±7.8)个、(31.4±6.9)个和(33.9±8.4)个。经统计学处理，miRNA-7前体干预组迁移细胞数显著少于阴性miRNA对照组、空脂质体组和空白对照组，差异均有显著统计学意义(均为P＜0.01);而阴性miRNA对照组、空脂质体组和空白对照组间差异均无统计学意义(均为P＞0.05;图2-图 3)。

Figure 2 In blank control cell migration images，more visible migration cells could be seen(×200) 空白对照组细胞迁移图，可见迁移细胞较多(×200)

Figure 3 In migration images of microRNA-7 precursor cell intervention groups，less visible migration cells could be seen(× 200)miRNA-7前体干预组细胞迁移图，可见迁移细胞较少(×200)

3 讨论

hRPE细胞是人眼视网膜内的重要细胞，在维持光感受器细胞正常代谢和功能中起关键作用，其最特异的功能在于它对感光细胞外节的吞噬作用。吞噬作用是视色素降解和再生循环周期中的一个环节。hRPE的吞噬作用有赖于细胞内的溶酶体系统。hRPE细胞无再生能力，不出现有丝分裂。细胞死亡后由邻近的细胞向侧面运动，移行衍生死亡细胞遗留下来的空间。hRPE的各项生理功能是否正常，受到来自脉络膜与视网膜的共同影响。随着年龄增长，视网膜中黑色素逐渐减少，而脂褐质逐渐增多。这种脂褐质的增加开始只发生在hRPE的基底膜侧，随年龄增加逐渐扩展至全部细胞质，而使hRPE细胞的代谢受影响。PVR的增生膜主要由色素上皮细胞、胶质细胞、纤维细胞、成纤维细胞和巨噬细胞构成［2］。hRPE细胞在PVR等增生性疾病的发生和发展过程中起重要作用，它不仅是增生膜形成和收缩的主要细胞，而且可以产生趋化因子，吸引纤维胶质细胞和成纤维细胞参与增生膜的形成。

EGF属于ErbB受体家族，在人体内多种组织中都有表达，参与调节增生、分化和发育［3-5］。PVR患者的玻璃体、视网膜下液以及增生膜中都有多种生长因子的存在和表达。张惠蓉等［6］用放射免疫法测定了PVR患者玻璃体中EGF的浓度，发现有显著升高，与血清中EGF无关，且PVR增生膜中 EGFR高表达。hRPE细胞的增生与生长因子及其受体的相互作用有关，相关研究证实EGF与EGFR特异性结合可刺激hRPE细胞的增生、移行，在PVR形成过程中起重要作用［7］。

miRNA是最近发现的一类内源性、非编码、长19～25个碱基的茎环形核苷酸转录物［8］，通过与靶基因的3’端非翻译区(3’-UTR)碱基完全或不完全配对结合，引起mRNA的降解或翻译抑制，在转录后调控细胞分化、增殖和凋亡。目前为止，有大约678种人类的miRNA序列被确认［9］，后续会有越来越多的人类miRNA被发现。研究发现，miRNA在多种不同的生理过程中均起关键作用，包括发育调控、造血细胞分化、神经系统发育、细胞凋亡、细胞增生和器官发育等，与肿瘤、病毒感染、代谢性疾病的发病也有关。

人视网膜中有多种miRNA分子的表达。对视网膜的320种基因进行分析后发现其中存在有67种miRNA分子的可能作用靶点［10］，miRNA-7就是其中的一种。miRNA-7由22个碱基组成，序列为5’-UUGUUUUAGUGAUCAAGAAGGU-3’。实验表明，EGFR mRNA的3’端非翻译区有3个miRNA-7的作用靶点，miRNA-7通过与之结合，抑制多种信号通路的激活，包括 ERK1/2，影响细胞的分化、增生和凋亡，从而参与病理生理过程。体外研究发现，miRNA-7通过与EGFR mRNA的非翻译区结合，抑制ERK1/2和Akt信号通路的激活，从而抑制肿瘤细胞的增生［11］。另外的研究发现，miRNA-7可以诱导细胞的凋亡［12］。在果蝇体内，在EGFR介导的转录抑制因子Yan降解的同时，miRNA-7高表达，并且通过与Yan的非翻译区结合抑制它的翻译，进一步降低Yan的水平，诱导光感受器细胞的分化［13］。

在本研究中我们采用Lipofectamine 2000转染试剂，以GFP为荧光标记物，转染24 h后观察，转染成功细胞的胞膜和胞浆中可见绿色荧光。当miRNA-7前体的终浓度为50 nmol·mL－1、脂质体的终浓度为2.5 μg·mL－1时，转染效率最高，达到 80% 以上;与空白对照组、空脂质体组及阴性 miRNA对照组比较，miRNA-7前体干预组中成熟 miRNA-7的表达较其他3组明显增加，差异均具有统计学意义(均为P＜0.05)，空脂质体组、阴性对照组与空白对照组之间差异均无统计学意义(均为 P＞0.05)。另外，与空白对照组、空脂质体组及阴性 miRNA对照组比较，miRNA-7对 hRPE细胞增殖有明显抑制作用。miRNA-7组细胞增殖抑制率(23.58%)明显高于阴性 miRNA 对照组(2.35%)、空脂质体组(2.97%)与空白对照组(0%)，差异均具有统计学意义(均为P＜0.05)，空脂质体组、阴性 miRNA对照组与空白对照组之间差异均无统计学意义(均为P＞0.05)。miRNA-7抑制hRPE细胞的迁移，细胞诱导5 h后，在miRNA-7前体干预组中，迁移细胞数明显较少，每高倍视野为(16.0±3.8)个，与其他3组比较差异均有统计学意义(均为P＜0.01);在阴性 miRNA对照组、空脂质体组和空白对照组中，迁移细胞数明显较多，每高倍视野分别为(32.2±7.8)个、(31.4±6.9)个和(33.9±8.4)个，3组间差异均无统计学意义(均为P＞0.05)。以往的研究已经证明丝裂原激活的蛋白激酶(mitogen activated protein kinase，MAPK)家族是介导细胞反应的重要信号系统，普遍存在于多种生物中。MAPK信号转导途径是由高度保守的三级酶促级联传递信号，通过苏氨酸和酪氨酸双位点磷酸化激活 MAPK［14］。根据序列的同源性和功能，MAPK家族分为4类，即 ERK1/2、c-Jun N端激酶(JNK)/应激活化蛋白激酶(SAPK)、p38及ERK5/BMK1［15］。激活的MAPK通过磷酸化核转录因子、细胞骨架蛋白及酶类等，参与细胞增生、分化、转化及凋亡的调节，并与炎症、肿瘤及其他多种疾病的发生机制密切相关。ERK1/2信号通路(Ras→Raf→MEK1/2→ERK1/2)是经典的MAPK信号转导途径，能被生长因子、血清及佛波酯等外界刺激激活。研究资料表明［16］，EGF可通过与细胞膜上的特异性酪氨酸激酶受体(EGFR)结合，激活ERK1/2信号通路，磷酸化与脯氨酸相邻的丝/苏氨酸，具有广泛的催化活性，介导多种生物学效应。本研究结果证实，miRNA-7可明显抑制 hRPE细胞的增殖和迁移，由于miRNA-7中不存在与 MMP-2和 MMP-9的 3’-UTR区基因互补序列，我们猜测这种抑制作用可能是由于miRNA-7对hRPE细胞的EGFR通路产生了良好的靶向沉默后效应，直接下调EGFR表达，从而阻断或部分阻断了ERK1/2信号通路，使得hRPE细胞的增殖和迁移受到明显抑制。

由于miRNA种类较多，与其他各种细胞因子作用广泛且交叉，加上其表达的组织特异性、时间差异性，我们对其真正的作用机制尚无深入了解，本实验只是初步证实miRNA-7可明显抑制hRPE细胞的增殖和迁移，为下一步的动物体内实验打下良好的理论基础。miRNA-7的研究尚处于起步阶段，其参与PVR等眼部增殖性疾病的发生、发展的其他机制有待于进一步研究。

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