Livin、PTEN及MMP-9在视网膜母细胞瘤中的表达及相关性研究

孙燕 张煦 王登廷 祝杰 郑吉琦

视网膜母细胞瘤(retinoblastoma，RB)患者在我国以婴幼儿多见，其中以新生儿的发病率为最高，据统计其RB发病率居眼内恶性肿瘤的首位，如果未能及时确诊并合理治疗，往往产生严重的后果，轻者摘除眼球，重者失去生命。依据我国的人口数量和新生儿出生率，每年RB新发病人数超过1100例，仅次于印度(每年超过1500例)。我国目前的5 a生存率为80%～85%，眼球保存率就更低了。化学治疗结合多次积极的局部治疗(serial aggressive local therapy，SALT)逐步上升为一线治疗，而外部放射治疗则降为二线治疗，眼球摘除为三线治疗。它的发生发展机制与RB基因密切相关，但RB基因并非是导致RB发生的唯一原因。与其他恶性肿瘤一样，RB的发生也是多因素共同作用的结果。

现有研究表明在RB的发生发展中，Livin、人第10号染色体缺失的磷酸酶及张力蛋白同源基因(phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten，PTEN)及基质金属蛋白酶-9(matrix metalloproteinase-9，MMP-9)起 到了很重要的作用［1-6］。Livin又名KIAP/ML-IAP，是在人基因组库中筛选克隆出的一种新型、有较强抗凋亡功能的凋亡抑制蛋白(IAPs)家族新成员，能够与凋亡蛋白酶结合，抑制其介导的细胞凋亡［7］。凋亡抑制蛋白Livin有明显的抗凋亡作用，在正常人的组织细胞中不表达或很少表达，而在肺癌、胃癌、肾细胞癌、黑色素癌、淋巴瘤、大肠癌和前列腺癌等肿瘤组织中异常高表达。PTEN是Li等［8］于1997年发现的一种新的抑癌基因，该基因在人类多种肿瘤中存在突变、缺失，是继p53基因之后发现的又一重要的抑癌基因。MMP-9属MMP家族中的明胶酶(W型明胶酶)类，大量研究表明，MMP-9在多种恶性肿瘤中呈现过表达，降解、破坏靠近肿瘤表面的细胞外基质，使肿瘤细胞能够沿着受损的基底膜向周围组织浸润，最终导致肿瘤的侵袭和转移［9］。

目前关于 Livin、PTEN及 MMP-9在 RB组织表达情况的研究比较少见，特别对三者相互关系的研究尚未见报道。我们采用免疫组织化学法研究PTEN、Livin及MMP-9的表达、共表达，其与RB发病以及与临床各型发生发展的关系，探讨RB可能的发生机制，并指导判断RB患者临床预后和治疗。

1 材料与方法

1.1 材料来源 选择兰州大学第二医院眼科在2000至2011年进行了眼球摘除术的RB患儿共56例(RB组)，年龄3个月～7岁，平均3.6岁;其中男29例，女27例。根据患儿的临床发展过程，划分为眼内期(21例)、青光眼期(19例)、眼外期(视神经浸润)(16例)、全身转移期(0例)。同时，另收集正常新鲜视网膜组织10例(正常视网膜组)，选择病患时注意挑选未经放射、化学药物及冷凝治疗者，以保证研究的准确性。将所收集标本常规石蜡包埋，预行HE染色及免疫组织化学SP染色。主要试剂:即用型兔抗人PTEN单克隆抗体(ZA-0251)、即用型兔抗人MMP-9多克隆抗体(BA0573)、DAB显色试剂盒(北京中杉生物技术有限公司)，即用型兔抗人Livin单克隆抗体(Rs-0738R，上海瑞奇生物科技有限公司)。

1.2 方法 采用SP免疫组织化学法，石蜡切片常规脱蜡水化，体积分数3.3%H2O2阻断灭活内源性过氧化物酶的活性，37℃孵育10 min，PBS冲洗3次。置 0.01 mol·L－1枸橼酸缓冲液(pH 6.0)中煮沸(95℃，15～20 min)，自然冷却20 min以上，再用冷水冲洗至室温行抗原修复，PBS冲洗;正常羊血清工作液封闭，37℃10 min;加入一抗(即用型兔抗人PTEN单克隆抗体、免抗人MMP-9多克隆抗体、免抗人Livin单克隆抗体)，抗体在室温下孵育2～3 h，经PBS冲洗3次，以 PBS(pH 7.4)代替一抗作阴性对照。加入二抗(即用型SP免疫组织化学染色试剂盒)，室温下孵育20 min，PBS冲洗;滴加辣根过氧化物酶标记的链霉素卵白素工作液，37℃孵育30 min，PBS冲洗3次，每次5 min;DAB/H2O2反应染色，在终止反应后苏木素复染，常规脱水、透明、干燥、封片。

1.3 判定标准 光镜下观察，RB切片组织中胞浆和(或)胞膜上出现较多棕黄色颗粒为阳性表达，无棕黄色颗粒出现为阴性表达。PTEN阳性结果为细胞核及细胞浆呈棕黄色着色，Livin的表达主要位于细胞膜，以出现清晰的棕黄色颗粒作为阳性结果判定，MMP-9以胞膜或胞质中出现明显的棕黄色或黄色的颗粒作为阳性判断结果。着色强度计分:无着色为0分，浅黄色为1分，棕黄色为2分，深棕褐色为3分。每张切片选取10个不同高倍视野(×40)各计数100个细胞，按阳性细胞所占的百分比计分:≤5%计0分，＞5%～25%计 1分，26%～50%计2分，51%～75% 计3分，＞75% 计4分。取两项合计，所有RB组及正常视网膜组病例均进行常规HE染色，然后请两名病理学专家对染色结果进行观察和复审的判定。

1.4 统计学处理 本实验数据采用SPSS 13.0软件进行统计学分析，其中干预前后、组间数据资料对比采用t检验，计数资料对比采用χ2检验，共表达的关系用相关分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 Livin、PTEN及 MMP-9的表达 RB组织中Livin阳性表达率高达57.1%(图1)，而在正常视网膜组织不表达(图2)，两者比较差异有统计学意义(P＜0.05)。RB中 PTEN蛋白表达阳性率为55.4%(图3)，正常视网膜10例 PTEN蛋白表达均阳性(图4)，阳性率为100.0%，两者比较差异有统计学意义(P＜0.05)。RB组织中MMP-9阳性表达率高达50.0%(图5)，在正常视网膜组织中不表达(图6)，两者比较差异有统计学意义(P＜0.05)。

Figure 1 Positive expression of Livin in RB(+++;SP，×20)Livin在RB中呈阳性表达(+++;SP，×20)

Figure 2 Negative expression of Livin in normal retinal tissue(SP，×20)Livin在正常视网膜中呈阴性表达(SP，×20)

Figure 3 Positive expression of PTEN in RB(++;SP，×20)PTEN在RB中呈阳性表达(++;SP，×20)

Figure 4 Positive expression of PTEN in normal retinal tissue(++;SP，×20)PTEN在正常视网膜中呈阳性表达(++;SP，×20)

Figure 5 Positive expression of MMP-9 in RB(+;SP，×40)MMP-9在RB中呈阳性表达(+;SP，×40)

Figure 6 Negative expression of MMP-9 in normal retinal tissue(SP，×40)MMP-9在正常视网膜中呈阴性表达(SP，×40)

PTEN、Livin、MMP-9表达与RB临床病理参数的关系见表1，由表1可见:(1)RB各年龄组中，不论PTEN蛋白表达或Livin、MMP-9蛋白表达在＞3岁儿童和≤3岁儿童间的阳性表达率差异均无统计学意义(均为 P＞0.05)。男女病例组间 PTEN蛋白、Livin蛋白、MMP-9蛋白表达比较，差异也均无统计学意义(均为P＞0.05)。(2)在 RB不同临床分期之间，1－2期RB组织中PTEN、Livin及MMP-9表达阳性率和3－4期阳性率相比，差异均有统计学意义(均为 P＜0.05)。(3)RB各临床类型中，PTEN、Livin及MMP-9蛋白表达在31例分化组织、25例未分化组织中表达阳性率与对照组(正常视网膜)比较，差异均有统计学意义(均为 P＜0.05)。(4)PTEN、Livin及MMP-9在有视神经浸润的RB组织中蛋白表达阳性率明显低于无视神经浸润者，差异均有统计学意义(均为P＜0.05)。

2.2 PTEN、Livin及 MMP-9的关系及共表达PTEN、Livin及MMP-9在RB中的蛋白表达呈一定的相关性。PTEN与 Livin的表达呈显著负相关(r=－0.370，P ＜0.05)，与 MMP-9 的表达也呈显著负相关(r=－0.310，P ＜0.05);而 Livin和 MMP-9 在 RB中的表达呈显著正相关(r=0.450，P ＜0.01)。性别与 MMP-9、Livin共表达无相关性(r=－0.130，P ＞0.05);临床分期与MMP-9、Livin共表达存在正相关(r=0.434，P ＜0.05)，说明临床分期越严重，MMP-9、Livin越容易共表达;视神经受侵犯程度与 MMP-9、Livin共表达存在正相关(r=0.470，P ＜0.05)，说明视神受经侵犯程越严重，MMP-9、Livin共表达的可能性较大;组织分化程度与 MMP-9、Livin共表达存在负相关(r=－0.566，P ＜0.01)，说明组织分化程度越好，MMP-9、Livin越不容易共表达(表2)。本实验中，PTEN表达与MMP-9、Livin共表达存在负相关(r=－0.542，P ＜0.01)，说明 PTEN 表达降低时，MMP-9、Livin共表达增加。

表1 PTEN、Livin、MMP-9表达与RB临床病理参数的关系Table 1 Relationship of PTEN，Livin，MMP-9 expression with clinic pathological parameters of RB

表2 MMP-9、Livin在RB患者性别、临床分期、视神经受侵犯程度、分化程度分类中的共表达Table 2 Co-expression of MMP-9 and Livin in classification with gender，clinical stages，optic nerve infiltration and tissue differentiation

3 讨论

目前联合研究 PTEN、Livin和 MMP-9在 RB中的表达及相互作用的相关报道不多。本研究表明Livin、MMP-9在 RB组织中的表达显著升高，PTEN在RB中的表达显著降低，说明它们在RB的发生发展、浸润和转移过程中起重要作用。

PTEN位于染色体10q23.3，全长200 kb，含有9个外显子和8个内含子。PTEN蛋白是一种多功能蛋白质，由氨基末端蛋白酪氨酸磷酸醇催化结构域和梭基末端的CZ结构域组成，具有蛋白磷酸酶活性和脂质磷酸酶活性。本研究发现正常视网膜组10例PTEN蛋白表达均阳性，阳性率为100.0%;而RB中PTEN蛋白表达阳性率为55.4%，两者比较差异有统计学意义(P＜0.05)。PTEN蛋白表达与年龄、性别无关，组织分化程度越高其表达越高，但随临床分期及视神经受浸润程度增加而显著降低(P＜0.05)。说明PTEN对RB的发生有抑制作用，PTEN的缺失或失活在RB的发病中发挥了重要作用。张杰等［3］同样发现PTEN蛋白的阳性表达率与临床分期、病理分型以及是否伴有视神经浸润有关，而与性别差异无关。连黎红等［1］发现 PTEN蛋白阳性表达在正常视网膜组织中较高，随组织分化程度、肿瘤细胞病理分型、临床分期的增高，PTEN蛋白阳性表达率明显下降。因此，PTEN基因表达水平下降可作为RB早期诊断的一个分子标记物。

凋亡抑制蛋白Livin又名KIAP/ML-IAP，能够与凋亡蛋白酶结合，抑制其介导的细胞凋亡，属IAPs家族新成员［7，10］。Livin 基因定位于染色体 20q13，全长 4.6 kb，包含 7 个外显子及 6 个内含子［11］。Livin可以在多种肿瘤细胞中及胎盘、胚胎组织中表达，但在多数正常成人组织中不表达，可能与肿瘤的形成和细胞增殖活跃密切相关［12］。本研究发现Livin的阳性表达与组织分化程度、临床分期及视神经受浸润程度显著相关，而与年龄、性别无关，可以作为检测RB恶性程度和转移能力的一个生物学指标。张萌等［6］发现肿瘤组 Livin阳性表达率比正常组显著增加;Livin阳性表达与RB组织病理学分型相关，但与临床分期无关。

MMP-9高表达与多种恶性肿瘤的不良预后有关。MMP-9主要来源于各种肿瘤细胞［13-14］。在正常生理情况下，组织中的MMP-9表达量极少，但是炎性细胞因子、激素以及生长因子等可改变其转录水平。MMP-9高表达可导致细胞外基质和血管基膜降解加速，使肿瘤细胞易于穿过细胞外基质和基膜移出癌巢，侵入血管及淋巴管发生浸润、转移，而且还对肿瘤细胞的黏附能力和能动性有影响［15-16］。本研究发现MMP-9的阳性表达在伴有视神经浸润及分化程度低的患者更高，而与年龄、性别无关。孟利娟［5］同样发现RB患者 MMP-9表达显著增加，未分化型RB组织及有视神经浸润RB组织中的MMP-9表达增加。所以，MMP-9可以作为检测RB恶性程度和转移能力的一个生物学指标。

本研究表明 PTEN、Livin及 MMP-9基因在 RB中的蛋白表达呈一定的相关性。PTEN与Livin的表达呈显著负相关，与 MMP-9的表达也呈显著负相关;而Livin和MMP-9在RB中的表达呈显著正相关。PTEN表达与MMP-9、Livin共表达存在负相关，说明PTEN表达降低时，MMP-9、Livin共表达增加，PTEN表达下降伴随着MMP-9高表达，说明在RB的发生发展中这两种因子可能起协同作用，而且PTEN对MMP-9的表达有抑制作用。可能的机制为:PTEN可通过蛋白磷酸酶活性调节局部黏着斑激酶(focal adhesion kinase，FAK)的磷酸化，而 MMP-9为 FAK的下游作用分子，PTEN低表达或缺失时，FAK的磷酸化水平增高，使MMP-9过表达，肿瘤细胞的侵袭能力相应增强。另外，PTEN表达下调可能使细胞间黏附能力降低，MMP-9的表达增加，进而促进肿瘤细胞向基质浸润。但PTEN是否可通过其他未知途径影响MMP-9的表达，进而影响肿瘤的侵袭和转移有待进一步研究。而且，PTEN表达与Livin的表达呈负相关。当PTEN在组织中的表达下调或缺失时，其对PI3K/AKT通路的抑制作用即减弱或消失，可导致AKT磷酸化，引起下游Livin基因的表达上调，随即启动一系列反应，从而抑制肿瘤细胞的凋亡［17］。

本研究结果表明，RB的发生和发展是多种因素协同作用的过程。RB组织中 MMP-9、Livin的激活与PTEN的失活或缺失之间可能存在相互协同作用，共同参与了RB的发生发展、转移及浸润。联合检测这3种基因蛋白对于评估RB的生物学行为具有重要价值，有助于估计患者的预后，为临床治疗提供依据，可能成为RB新的分子靶向治疗位点。

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