非转移性黑色素瘤糖蛋白B在增生性玻璃体视网膜病变及视网膜色素上皮细胞中的作用

司艳芳 樊旭 关娟 周历 赵娟

增生性玻璃体视网膜病变(proliferative vitreoretinopathy，PVR)是裂孔源性视网膜脱离手术失败常见的原因［1］。在 PVR膜的细胞成分中最重要的细胞之一是视网膜色素上皮(retinal pigment epithelium，RPE)细胞。研究发现，RPE细胞的增生与PVR发病机制相关［2-5］。非转移性黑色素瘤糖蛋白 B(glycoprotein nonmetastatic melanoma protein b，GPNMB)是一种Ⅰ型跨膜糖蛋白［6］，广泛表达于多种组织［7］。研究表明GPNMB与多种疾病的生理、病理过程相关［8］。但尚未有文献报道GPNMB对RPE细胞生物学功能的影响。因此，本研究采用免疫荧光、酶联免疫吸附试验、MTT等方法，检测GPNMB在不同病变程度PVR中的定量表达以及GPNMB对RPE细胞增殖、细胞周期的影响，拟在探讨GPNMB在PVR病变中的作用。

1 材料与方法

1.1 材料来源 收集解放军309医院在2012年1月至12月确诊的18例PVR患者的视网膜表面增生膜。患者年龄15～60岁。PVR病变程度分级标准参照1991年美国视网膜学会的分级方法，分为A、B、C 3级。

1.2 主要仪器及试剂 CO2细胞培养箱(Binder公司，德国)，酶联免疫检测仪(Sheldon公司，美国)，流式细胞仪(Olympus，日本)，激光共聚焦显微镜(Bio-Rad公司，美国)。限制性内切酶 EcoRI、XhoI，T4连接酶，RNA 酶，胰蛋白酶(Takara，大连)，LipofectamineTMRNAiMAX，载体 pMD19-T、pcDNA3.1(+)(Invitrogen，美国)，抗 GPNMB抗体、抗生物素标记的Texas Red、FITC标记的膜联蛋白(Abcam，美国)，M254 培养基、G418、MTT、碘化吡啶(GIBCO BRL，美国)。

1.3 引物及 siRNA GPNMB-P1:5’-AACCTTGAGTGCCTGCGTC-3’，GPNMB-P2:5’-ACTT-CCCCAAACCACAATATCTA-3’;GPNMB-P3:5’-CCGGAATTCATGGAATGTCTCTACTATTTCCTGGGAT-3’，含 EcoRI酶切位点;GPNMB-P4:5’-CCGCTCGAGTCATTAAGAAACTCCTTTAAATTCTTG-3’，含 XhoI酶切位点。靶向 GPNMB的 siRNA序列:GPNMB(sense:5’-GGGCAAUGAAAGACCUUCUTT-3’，antisense:5’-AGAAGGUCUUUCAUUGCCCTT-3’)。所有引物均由上海生工合成。

1.4 方法

1.4.1 免疫荧光 石蜡标本常规脱蜡，进行如下操作:滴加正常羊血清(1∶50稀释)，室温温育 30 min;漂洗后与抗 GPNMB(1∶50稀释)一抗于4℃孵育过夜;漂洗后与生物素标记的二抗(1∶50稀释)在37℃温育30 min;最后滴加抗生物素标记的Texas Red(1∶1000稀释)，于37℃放置30 min。磷酸盐缓冲溶液(phosphate buffer saline，PBS)漂洗后用甘油封片，于激光共聚焦显微镜下观察并进行定量分析。同时设有PBS替代一抗的空白对照。

1.4.2 酶联免疫吸附试验 于患者玻璃体切割术前抽取3 mL静脉血，离心取血清－20℃保存。采用酶联免疫吸附试剂盒检测血清中GPNMB的含量。以我院检验科健康成年查体者作对照，抽血离心取血清－20℃保存。

1.4.3 人RPE细胞的分离及培养 摘取尸眼球，将眼球放入含200 mg·L－1庆大霉素的 RPMI1640培养液中，自角膜缘后5 mm环形剪开眼球壁，弃眼球前段，在解剖显微镜下切除、吸净玻璃体，用 DHank液清洗眼杯2次，加入215 kU·L－1透明质酸酶和1.25 g·L－1胰蛋白酶混合液，置于37℃孵箱中消化3 min，弃酶混合液，仔细分离神经上皮层，于视盘周围将其剪除，继以2.5 g·L－1胰蛋白酶加入眼杯中，置于37℃孵箱中消化70 min，取出眼杯，用吸管轻轻吹打使细胞脱落，收集RPE细胞悬液;6000 r·min－1离心15 min，弃上清液，将细胞悬浮于培养液中，然后接种于培养瓶，于37℃、体积分数5%CO2培养箱中培养。

1.4.4 真核表达载体的构建 以实验室保存的GPNMB序列为模板，以 GPNMB-P1、GPNMB-P2引物扩增 GPNMB目的片段，与 pMD19-T载体在16℃条件下进行连接反应，并将连接产物转化于感受态大肠杆菌 DH5α，培养后进行筛选，挑选阳性菌落摇菌并提取质粒，电泳鉴定后获得重组质粒pMD19T-GPNMB。以重组质粒为模板，以 GPNMBP3、GPNMB-P4为引物，扩增 GPNMB编码区序列，扩增产物以EcoRI、XhoI双酶切，并用T4 DNA连接酶将其与经相同酶切的真核表达载体 pcDNA3.1(+)连接，筛选获得重组表达载体 pcDNA3.1(+)-GPNMB。

1.4.5 转染 按每孔50×103个 RPE细胞接种至24孔培养板中，待其长至50%融合时按脂质体L2000的操作说明进行转染。具体方法:加入100 μL无血清 M254培养基(内含 siRNA 6 pmol，Lipofectamine 1 μL)，混匀后于体积分数5%CO2、37 ℃恒温培养箱中孵育，24 h后经G418筛选，获得稳定表达GPNMB的RPE细胞。

1.4.6 细胞增殖实验 将 RPE细胞接种于96孔培养板上，置于37℃、体积分数5%CO2孵箱中培养48 h。将实验分为对照组、GPNMB转染组及空载体转染组，2.5 g·L－1胰蛋白酶消化各组 RPE 细胞，吸去胰蛋白酶，加入正常培养液继续培养60 min。每孔加入 MTT 溶液(5 g·L－1)20 μL，继续孵育4 h，弃上清，每孔加入150 μL DMSO，振荡10 min后进行比色测定，酶联免疫检测仪在490 nm波长下读取OD值。

1.4.7 细胞周期实验 PBS洗涤RPE细胞1次，加FITC-Annexin-V(fluroscein isothiocyanate-Annexin-V)，室温避光放置20 min，PBS洗涤2次，加500 μL甲醛，冰浴25 min，PBS洗涤2次，加入含有10 mg·L－1碘化吡啶和1 g·L－1RNA酶的 PBS缓冲液，室温避光孵育20 min，待流式细胞仪检测。空白对照组采用培养基假诱导［9］。

1.5 统计学分析 以SPSS 11.0统计分析软件进行统计，组间比较采用方差分析，P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 GPNMB在PVR增生膜中的表达 运用计算机分析系统对PVR增生膜中GPNMB的荧光量作定量分析。结果如图1所示，A级 PVR的增生膜中GPNMB阳性荧光总量为5.07，而 B级膜中 GPNMB荧光总量为 11.21，C级膜中 GPNMB荧光总量为19.34。该结果表明了PVR病变程度越高，GPNMB的荧光强度越强，因此，我们推断GPNMB与PVR疾病有着密切的关系。

Figure 1 Expression of GPNMB in PRM of PVR(*P ＜0.05，＊＊P＜0.01)GPNMB在 PVR 增生膜中的表达(*P＜0.05，＊＊P＜0.01)

2.2 GPNMB在PVR患者血清中的表达 为了进一步验证免疫荧光实验的结果，我们采用酶联免疫吸附试验法检测了PVR患者血清中的 GPNMB含量。结果如图2所示，与正常人血清中GPNMB的含量相比，PVR患者血清中GPNMB的含量有显著上升，该结果表明GPNMB可以作为PVR患者血清的生物标志物用于PVR疾病的诊断。

Figure 2 Expression of GPNMB in the serums of patients with PVR GPNMB在PVR患者血清中的表达水平

2.3 GPNMB对RPE细胞增殖的影响 RPE细胞是PVR病理过程的关键因素之一，因此我们研究了GPNMB对RPE细胞的作用，这对进一步研究PVR的发病机制有着重要意义。通过MTT法测定各组反应细胞数的OD值，结果如图3所示，与对照组相比，空载体转染组基本无变化，GPNMB转染组则可以显著促进RPE细胞的增殖，其OD值是对照组的3.7倍，差异有统计学意义(P＜0.05);然后以 GPNMB过表达的人RPE细胞为研究对象，加入GPNMB-siRNA观察它对 RPE细胞增殖的影响，结果表明GPNMB-siRNA转染组可以显著抑制RPE细胞的增殖(P＜0.05)。该结果说明了 GPNMB在 RPE细胞增殖过程中起着重要作用。

Figure 3 Effects of GPNMB on proliferation of RPE cells.A:Overexpression-GPNMB could significantly promote the proliferation of RPE cells;B:GPNMB-specific siRNA could obviously inhibit the proliferation of RPE cells treated with overexpression-GPNMB GPNMB对RPE细胞增殖的影响。A:GPNMB过表达可以显著促进RPE细胞的增殖;B:特异性的GPNMB-siRNA可以显著抑制GPNMB过表达处理的RPE细胞的增殖

2.4 GPNMB对RPE细胞周期的影响 细胞周期与细胞增殖有着密切的联系，因此我们推断GPNMB可能通过调控RPE细胞周期来促进其增殖。GPNMB处理无血清培养的RPE细胞24 h后，流式细胞仪检测GPNMB转染对细胞周期的影响。结果如图4所示，与对照组相比，GPNMB过表达及 siRNA对细胞周期均有显著影响，因此，GPNMB通过细胞周期调控途径促进RPE细胞的增殖。

3 讨论

Figure 4 Effects of GPNMB on RPE cells cycle.A:Image of RPE cells cycle;B:GPNMB-siRNA could decrease the percentage of S phase of RPE cells cycle;C:GPNMB-overexpression could increase the percentage of S phase of RPE cells cycle GPNMB对RPE细胞周期的影响。A:RPE细胞周期图;B:GPNMB-siRNA可降低RPE细胞周期S期细胞的百分比;C:GPNMB过表达可增加RPE细胞周期S期细胞的百分比

PVR是一种以细胞增生及牵拉性视网膜脱离为特征的眼部疾患;是孔源性视网膜脱离和眼外伤最严重的并发症，常常引起失明和眼球萎缩。它的基本病理过程是眼内细胞，包括 RPE细胞、神经胶质细胞和成纤维细胞样细胞等移行进入玻璃体内;黏附在玻璃体视网膜界面上，增生产生细胞外基质，在玻璃体内及视网膜表面形成有收缩能力的膜;膜收缩牵拉视网膜脱离，视力丧失［10］。GPNMB作为一种糖基化的跨膜蛋白，参与了多种细胞的生理功能。最近研究表明GPNMB在多种细胞的增生过程中起到重要作用［11-13］，因此，本文研究了 GPNMB与 PVR的关系以及GPNMB对RPE细胞的作用。

免疫荧光结果显示，PVR增生膜的病变程度越高，GPNMB的荧光强度越强，该结果表明了GPNMB与PVR疾病的发展过程可能有着密切的联系。为了验证GPNMB与PVR疾病有关系，我们采用酶联免疫吸附试验比较了正常人与PVR患者血清中GPNMB的含量，结果表明PVR患者血清中GPNMB的含量远高于对照组，由此我们推测GPNMB可以作为PVR患者血清的生物标志，用于PVR疾病的诊断。PVR的发病机制主要是与RPE细胞的病理性增生相关，结合GPNMB在RPE细胞中有表达，我们推测GPNMB对RPE细胞的增生可能起着一定的作用。本实验我们构建了GPNMB的siRNA以及过表达载体，采用转染的方法将其转入RPE细胞，然后采用MTT法检测GPNMB对RPE细胞增殖的影响。结果表明GPNMB-siRNA可以显著抑制RPE细胞的增殖，而GPNMB过表达则会显著促进其增殖，由此我们推测GPNMB可能是RPE细胞的一个调控分子，影响着它的增生，进而导致PVR的发展。流式细胞仪测定RPE细胞周期结果显示，GPNMB转染组的S期细胞比例与无血清培养的对照组相比有明显的增加，而GPNMB-siRNA转染组则显著减少，进一步印证了MTT的实验结果。

综上所述，GPNMB作为PVR中的一个关键分子，通过细胞周期调控途径影响RPE细胞的增殖，但其具体作用机制还有待于进一步研究，这为PVR的预防及治疗提供了有益的思路。

1 惠延年.增生性玻璃体视网膜病变:带入21世纪的课题［J］.中华眼底病杂志，1999，15(2):67-68.

2 Lu B，Malcuit C，Wang S，Girman S，Francis P，Lemieux L，et al.Long-term safety and function of RPE from human embryonic stem cells in preclinical models of macular degeneration［J］.Stem Cells，2009，27(9):2126-2135.

3 Carr AJ，Vugler A，Lawrence J，Chen LL，Ahmado A，Chen FK，et al.Molecular characterization and functional analysis of phagocytosis by human embryonic stem cell-derived RPE cells using a novel human retinal assay［J］.Mol Vis，2009，15(3):283-295.

4 Chuang JZ，Chou SY，Sung CH.Chloride intracellular channel 4 is critical for the epithelial morphogenesis of RPE cells and retinal attachment［J］.Mol Biol Cell，2010，21(17):3017-3028.

5 Lewis GP，Matsumoto B，Fisher SK.Changes in the organization and expression of cytoskeletal proteins during retinal degeneration induced by retinal detachment［J］.Invest Ophthalmol Vis Sci，1995，36(12):2404-2416.

6 Rose AAN，Grosset AA，Dong Z，Russo C，MacDonald PA，Bertos NR，et al.Glycoprotein nonmetastatic B is an independent prognostic indicator of recurrence and a novel therapeutic target in breast cancer［J］.Clin Cancer Res，2010，16(7):2147-2156.

7 Hoashi T，Sato S，Yamaguchi Y，Passeron T，Tamaki K，Hearing VJ.Glycoprotein nonmetastatic melanoma protein b，a melanocytic cell marker，is a melanosome-specific and proteolytically released protein［J］.FASEB J，2010，24(5):1616-1629.

8 Tomihari M，Hwang SH，Chung JS，Cruz Jr PD，Ariizumi K.Gpnmb is a melanosome-associated glycoprotein that contributes to melanocyte/keratinocyte adhesion in a RGD-dependent fashion［J］.Exp Dermatol，2009，18(7):586-595.

9 Okazawa M，Shiraki T，Ninomiya H，Kobayashi S，Masaki T.Endothelin-induced apoptosis of A375 human melanoma cells［J］.J Biol Chem，1998，273(20):12584-12592.

10 Wang C，Cao GF，Jiang Q，Yao J.TNF-α promotes human retinal pigment epithelial(RPE)cell migration by inducing matrix metallopeptidase 9(MMP-9)expression through activation of Akt/mTORC1 signaling［J］.Biochem Biophys Res Commun，2012，425(1):33-38.

11 Rose AAN，Siegel PM.Emerging therapeutic targets in breast cancer bone metastasis［J］.Future Oncol，2010，6(1):55-74.

12 Xiao Y，Qiao Z，Zhang X，Liu Z，Xie J，Hao Y，et al.Expression of glycoprotein non-metastatic melanoma protein B in prostate cancer and its significance［J］.Health Sci，2011，43(4):496-499.

13 Zhang P，Liu W，Zhu C，Yuan X，Liu D，Gu W，et al.Sliencing of GPNMB by siRNA inhibits the formation of melanosomes in melanocytes in a MITF-independent fashion［J］.PLoS One，2012，7(8):e42955.