一株红螺菌科光合细菌培养基的配比优化

李立欣，罗克洁，唐二葵，马 放

( 1．黑龙江科技大学环境与化工学院，哈尔滨150022; 2．哈尔滨工业大学城市水资源与水环境国家重点实验室，哈尔滨150090)

一株红螺菌科光合细菌培养基的配比优化

李立欣1，罗克洁1，唐二葵1，马 放2

( 1．黑龙江科技大学环境与化工学院，哈尔滨150022; 2．哈尔滨工业大学城市水资源与水环境国家重点实验室，哈尔滨150090)

为获得一种高效培养光合细菌L－01的方法，采用表征菌体密度的参数OD660作为评价指标，通过单因素实验和正交实验分析其对碳源、氮源、磷源和生长因子的利用能力。结果表明，乙酸钠为光合细菌L－01的最大影响因子，其优化培养基配方为:乙酸钠7 g/L、氯化铵0. 25 g/ L、磷酸氢二钾0. 1 g/L、酵母膏0. 2 g/L、氯化镁0. 2 g/L和九水硫化钠0. 3 g/L。该结果为高密度培养光合细菌提供了基础数据。

光合细菌;培养基;优化;正交实验

收稿日期: 2013－12－16
基金项目:“十二五”国家科技支撑计划项目( 2012BAD14B06－04) ;黑龙江省教育厅科学技术研究项目( 12513088)
第一作者简介:李立欣( 1980－)，男，黑龙江省鹤岗人，讲师，博士研究生，研究方向:环境微生物及藻类固定化技术与工艺，E-mail: lilixin1980@163．com。

0引言

光合细菌( photosynthetic bacteria，PSB)是一类以光作为能源，能在光照厌氧或黑暗好氧条件下利用有机物、硫化物、氨等作为供氢体兼碳源进行光合作用的微生物［1］。它与其他高等植物和藻类相比，最大的区别就是仅限于厌氧光照条件下生长且不产生氧气［2］。在自然界中，光合细菌分布极其广泛，只要有水和光存在，不论在好氧和厌氧环境如土壤、泥潭沼泽、海水、淡水、下水污泥、水生植物根系等均能生长繁殖。目前所知的光合细菌可分为着色杆菌科、紫色非硫细菌、外硫红螺菌科、螺旋杆菌科、绿色硫细菌、含细菌叶绿素的专性好氧菌、多细胞丝状绿细菌等七大类群［3］。

光合细菌菌体含有多种物质，如蛋白质、多种B族维生素、泛酸、辅酶Q等生理活性物质，同时含有菌绿素、类胡萝卜素等天然色素，其用途极为广泛，具有很强的回收价值［4］。随着人们对光合细菌研究的不断深入，证明光合细菌在农业生产、水产养殖、畜牧业、生物制氢、生物制药、重金属废水处理和有机污水处理方面均有很好的应用价值［5－9］。

基于光合细菌在水处理等方面的优势，本应加大推广力度，但由于用于培养光合细菌的培养基具有平均富集时间较长、培养基成分种类多以及成本较高等不足，所以限制了光合细菌在生产上的广泛应用［5］。为此，笔者以光合细菌中的红假单胞菌属为材料，在单因素实验的基础上，采用正交实验方法对光合细菌的培养基条件进行优化，得到改进的培养基配方，为下一步光合细菌的开发及利用提供参考依据。

1实验材料与方法

1．1实验材料

菌种为课题组从黑龙江科技大学水处理站活性污泥中分离获得并培养保存，经初步鉴定为红假单胞菌属( Rhodopseudomonas sp．)，命名为L－01。

培养基成分与质量浓度:磷酸氢二钾0. 5 g/L、乙酸钠4 g/L、氯化铵0. 5 g/L、酵母膏0. 5 g/L、氯化镁0. 2 g/L、九水硫化钠0. 3 g/L、pH值7. 0。

培养条件以质量浓度20%的接种量将光合细菌L－01菌种接种于灭菌的试剂瓶中，在光照培养箱中3 000 lux光照强度下厌氧培养，pH =7. 0，温度30℃，培养时间为7 d。每一实验组设置3个重复。

菌种光密度值测定采用723型分光光度计。在660 nm处测定OD值，以此来判断菌种的生长状况。

1. 2培养基单因子优化实验

根据培养基的主要组成成分，以及前期实验结果，设置了4组单因素实验，分别为碳源(乙酸钠1.0～9.0 g/L)、氮源(氯化铵0.25～1.25 g/L)、磷源(磷酸氢二钾0.10～0.50 g/L)、生长因子(酵母膏0.2～1.0 g/L)。

1. 3 正交实验

根据单因素实验的结果设计了4因素3水平的正交实验，采用L9( 34)正交表筛选光合细菌L－01的最佳培养基配方，正交实验的因素水平见表1。

表1 L9( 34)正交实验因素水平Table 1 Factors and levels of L9( 34) orthogonal experiment g/L

2结果与分析

2．1培养基单因子对光合细菌生长的影响

分别添加不同质量浓度的碳源(乙酸钠)、氮源(氯化铵)、磷源(磷酸氢二钾)和营养因子(酵母膏)，考察对光合细菌L－01生长的影响。从图1a可以看出，乙酸钠的质量浓度对光合细菌L－01生长影响较大，随着添加量的增加有利于光合细菌L－01的生长，在添加量5～9 g/L时，光合细菌L－01的OD值差异并不显著。考虑到添加量大必然会增加大规模培养的成本，因此乙酸钠添加量为5 g/ L左右较为适宜。在氯化铵添加实验组中，从图1b可以看出，适量的氯化铵能够促进光合细菌L－01的生长，而过量的氯化铵反而会抑制其生长，选择0. 75 mg/L的氯化铵较为理想。图1c为不同磷酸氢二钾质量浓度下光合细菌L－01的光吸收值，当磷酸氢二钾添加量过低时，菌液OD值也能达到1. 0以上，说明光合细菌L－01对磷源的需求量并不大。随着磷酸氢二钾添加量的增加对光合细菌的生长量影响不大，当添加量大于0. 3 mg/L时，OD值略有下降，说明较低添加量有利于光合细菌L－01的生长。酵母膏添加对光合细菌L－01生长影响见图1d。实验中适量添加酵母膏有利于光合细菌L－01的生长，当添加质量浓度较低时，随着添加量的增加OD值增加，当添加量达到0. 6 g/L时，OD值达到最大。大于0. 6 g/L的添加量时，抑制了光合细菌L－01的生长。虽然光合细菌L－01培养初期生长迅速，菌密度增长迅速，但菌体易出现老化，易出现细胞碎片附壁、死细胞附壁和聚团成块现象。为减少其他杂菌污染，结合生产中要降低成本，酵母膏最适添加量为0. 2～0. 6 g/L。

图1四种单因子添加量对L－01生长的影响Fig．1 Effects of adding concentration of nutrition factors respectively on growth of PSB L－01

2. 2 正交实验结果及分析

正交实验结果见表2。从表2中的极差R值可以看出，各因素影响光合细菌生长的主次顺序为: B＞D＞A＞C，即乙酸钠质量浓度对光合细菌L－01生长的影响最为显著，酵母膏质量浓度对光合细菌L－01生长的影响次之，氯化铵质量浓度对光合细菌L－01生长的影响最小。该结果与钟为章等［2］研究结果一致，说明两株菌利用碳源及氮源等营养元素能力较为相似，可以推断乙酸钠作为碳源是光合细菌生长较为理想的营养成分，有研究显示加大碳源的用量，可以增长光合细菌生长［10］。酵母膏质量浓度对光合细菌L－01影响较大，这主要是由于酵母膏营养丰富，为光合细菌提供各种生长因子，促进光合细菌的生长［11］。氯化铵和磷酸氢二钾质量浓度对光合细菌L－01影响较小，说明光合细菌L－01对氮源及磷源的质量浓度要求很低，低质量浓度氮源和磷源条件下光合细菌L－01生长代谢仍然旺盛。

表2正交实验结果Table 2 Results of orthogonal experiment

根据表2均值大小，最佳培养基配方组为A3B3C1D1，但综合极差R大小、营养因子均值差以及成本考虑，笔者认为A1B3C1D1为光合细菌L－01的最佳培养基配方，即磷酸氢二钾0. 1 g/L、乙酸钠7 g/L、氯化铵0. 25 g/L、酵母膏0. 2 g/L。

3结论

培养基中四种主要单因素营养因子对光合细菌L－01的生长影响依次为乙酸钠、酵母膏、磷酸氢二钾、氯化铵。根据正交实验确定最佳培养基配方，即乙酸钠7 g/L、磷酸氢二钾0. 1 g/L、氯化铵0. 25 g/ L、酵母膏0. 2 g/L、氯化镁0. 2 g/L和九水硫化钠0. 3 g/L。

［1］ 赵 微，张光明．微量元素对废水中光合细菌生长的影响［J］．哈尔滨工业大学学报，2012，44( 2) : 52－55．

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［3］东秀珠，蔡妙英．常见细菌系统鉴定手册［M］．北京:科学出版社，2001．

［4］ 卢海凤，张光明，何春华．一株光合细菌的鉴定及其处理大豆加工废水试验［J］．哈尔滨工业大学学报，2011，43( 12) : 72－76．

［5］ 钱森和，厉荣玉，汤 斌，等．紫色非硫光合细菌培养基条件优化的研究［J］．安徽工程科技学院学报，2007，22 ( 2) : 4－8．

［6］ 李福枝，刘 飞，曾晓希，等．光合细菌( PSB)应用的研究进展［J］．食品与机械，2008，24( 1) : 152－156．

［7］ 揭 晶，赵 越．光合细菌应用的研究进展［J］．广东药学院学报，2006，22( 1) : 113－115．

［8］ 贾 培，邓 旭．光合细菌处理重金属废水的研究进展［J］．工业水处理，2011，31( 1) : 13－17．

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［11］ 卢宪辉，金佩玉，纪玉蕊，等．适合海水养殖使用的光合细菌培养基的优化［J］．安徽农业科学，2010，38( 4) : 1704－1706．

(编辑 徐 岩)

Optimization of medium for strains photosynthetic bacteria of Rhodospirillaceae

LI Lixin1，LUO Kejie1，TANG Erkui1，MA Fang2
( 1．School of Environmental＆Chemical Engineering，Heilongjiang University of Science＆Technology，Harbin 150022，China; 2．State Key Laboratony of Urban Water Resource＆Environment，Harbin Institute of Technology，Harbin 150090，China)

This paper features a highly effective approach to culturing photosynthetic bacteria L－01．The approach is developed by analyzing photosynthetic bacteria L－01’s capability of using carbon source，nitrogen source，phosphorus source，and growth factor，using as the evaluation index the parameter OD660characterizing the density of bacteria and by virtue of single factor experiment and orthogonal experiment analysis．The analysis finds that acetate sodium behaves as the biggest impact factor of photosynthetic bacteria L－01，with the optimized culture medium ingredients composed of CH3COONa 7 g/L，NH4Cl 0．25 g/L，KH2PO40．1 g/L，yeast extract 0．2 g/L，MgCl20．2 g/L and NaS·9H2O．The finding may serve as the basic data for high-density culturing of photosynthetic bacteria．

photosynthetic bacteria; culture medium; optimization;orthogonal experiment

10. 3969/j．issn．2095－7262. 2014. 02. 007

Q935

2095－7262( 2014) 02－0141－03

A