穴位埋线对慢传输型便秘大鼠Cajal间质细胞的影响

尹平,徐世芬,高宁阳,吴君怡,朱博畅

(1.上海中医药大学附属上海市中医医院,上海 200071;2.上海市中医药研究院骨伤科研究所,上海 201203)

慢传输型便秘(slow transit constipation,STC)是一类以结肠传输减慢为特点的顽固性便秘,约占功能性便秘的45.5%,临床上最为常见[1]。STC病程较长,内科各种保守治疗措施效果有限,大多数患者需要长期依赖各种刺激性泻剂排便,部分患者最终需手术切除传输迟缓的结肠方能解除症状[2]。所以,探寻其有效的治疗方法是我们医学领域的研究方向。近年来,较为统一的研究观点认为Cajal间质细胞在结肠中的分布和功能异常可能是STC结肠慢波频率减慢的直接或间接原因。而穴位埋线作为目前临床治疗STC的有效方法之一,兼具操作简便、经济省时、易于患者接受的特点。故本研究拟通过观察穴位埋线对STC模型大鼠肠道传输功能及其结肠组织 Cajal间质细胞的影响,探讨穴位埋线治疗STC的可能作用机制及不同穴位调节STC的穴位特异性。

1 材料与方法

1.1 实验动物

清洁级SD大鼠34只,体质量(180±10)g,雌雄各半,由上海中医药大学动物实验中心提供,动物合格证号为SCXK(沪)2008-0016。实验动物饲养于上海中医药大学实验动物中心,给予标准光照周期(14 h光照、10 h黑夜),室内温度(20±2)℃,湿度(50±10)%,标准饲料,高压灭菌垫料和饮水。实验动物中心许可证号为SYXK(沪)2004-0005。

1.2 主要试剂及器材

冰冻包埋切片机(CM3050S,德国 Leica),倒置显微镜(1X71,日本 Olympus),电热恒温水浴锅(DK-S26型,上海精宏实验设备有限公司),电子天平(JA10002,上海精天电子仪器有限公司),兔多抗 c-kit抗体(一抗)(美国abcam公司),SABC(兔IgG)-POD kit试剂盒(免疫组化试剂盒)(北京索莱宝科技有限公司),大黄颗粒剂(产品批号为 1106202,江阴天江药业有限公司),无菌注射针(规格 Ø0.7×32 TWLE,上海米沙瓦医科工业有限公司),医用羊肠线(规格为 3～0,B30,铬制,上海浦东金环医疗用品有限公司),平头毫针(规格0.30 mm×50 mm,无锡佳健医疗器械有限公司)。

1.3 实验方法

1.3.1 动物分组

将34只SD大鼠随机分为5组,即正常组(6只)、模型组(7只)、天枢组(7只)、上巨虚组(7只)及大肠俞组(7只)。

1.3.2 模型制备

参照文献[3]方法,模型组、天枢组、上巨虚组及大肠俞组每只大鼠给予每日灌服大黄粉悬液,首次大黄用量为200 mg/(kg·d),以此递增直至出现半数大鼠粪便变稀,然后保持此剂量至80%的稀便消失,然后再在此基础上按200 mg/(kg·d)递增给药,直到又有近半数大鼠出现腹泻,如此循环3次,待最后1次80%稀便消失,然后停止给药1星期,从而诱导实验性STC大鼠模型。采用首粒黑便排出时间判定模型成功建立与否。

1.3.3 穴位选择及处理方法

天枢、上巨虚、大肠俞穴位定位参照林文注主编《实验针灸学》[4]。

天枢组、上巨虚组及大肠俞组每只大鼠,在造模成功的基础上,分别给予天枢、上巨虚及大肠俞穴位埋线处理,每7 d治疗1次,4次为1个疗程,共计28 d。

穴位埋线操作方法,先将“3～0”医用羊肠线剪成长度约为0.5 cm的线段若干,置于消毒弯盘中,然后将羊肠线从注射针的针尖处穿入(此时线头与针尖内缘齐平)。消毒穴位区相应皮肤,然后将无菌注射针刺入相应穴位到达预定深度,先稍稍后退针,随后用手指抵住毫针针尾做注射状,缓慢将羊肠线推入穴位内,当注射针内有空虚感时,方可出针,并确认羊肠线已埋入大鼠肌内,埋线完毕,大鼠穴位处无需特殊处理。

1.3.4 组织取材

治疗结束后,各组大鼠均禁食、不禁水24 h。采用100 g/L活性碳悬液2 mL灌胃30 min后,颈椎脱臼法处死。剖腹立即取距盲肠端2 cm处结肠组织约1 cm,用预冷生理盐水冲洗肠内容物,装入预先标记分组的冻存管后迅速投入液氮,于﹣70℃超低温冰箱保存备用。

1.3.5 观察指标及测试方法

1.3.5.1 大鼠6 h内首粒黑便排出时间、大便重量及碳推进百分率(%)

采用活性碳灌胃法测定,经口灌入100 g/L的活性碳悬液2 mL,并将大鼠分别予代谢笼里观察,从活性碳灌胃完毕开始计时,记录从灌胃到大鼠首粒黑便排出时间,6 h内大便重量。

采用活性碳推进试验检测肠道传输功能,碳推进百分率(%)=(碳末前端与幽门的距离/肠道全长)×100%。摘除从幽门到直肠末端的全部肠道,在松弛状态下测量肠道的全长及活性碳悬液在肠道内推进的长度,并计算活性碳悬液推进长度与肠道全长的百分比。

1.3.5.2 Cajal间质细胞的免疫组化染色

结肠组织用OCT包埋后放于冰冻切片机中,每个标本连续切片3张,片厚5 μm,按照SABC(兔IgG)-POD kit试剂盒说明书操作。切片于PBS缓冲液浸泡5 min,枸橼酸钠热修复抗原,自然冷却3～5 min后,PBS缓冲液浸泡5 min。置3%双氧水中孵育10 min,用PBS缓冲液冲洗2 min×3次。滴加适当稀释的兔抗鼠多克隆c-kit抗体(按1:200稀释),湿盒内﹣4℃孵育过夜,PBS缓冲液冲洗2 min×3次。滴加二抗,室温孵育30 min,PBS缓冲液冲洗2 min×3次。DAB显色10 min,蒸馏水冲洗,苏木素复染5 min,常规脱水,封片。在Olympus(1X71)型荧光倒置相差显微镜下,每张切片随机选3个高倍镜视野(10×40)观察,应用Image-Pro Plus 5.0图形分析系统拍照并计算Cajal间质细胞免疫染色阳性细胞个数。

1.4 统计学方法

所得数据均以均数±标准差表示。采用SPSS16.0统计软件进行数据分析。采用One-way-ANOVA单因素方差分析进行统计,P＜0.05被认为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠6 h内首粒黑便排出时间、大便重量及碳推进百分率的比较

由表1可见,大鼠6 h内首粒黑便排出时间,模型组、大肠俞组(P＜0.01)及上巨虚组(P＜0.05)均高于正常组;天枢组与正常组比较差异无统计学意义(P＞0.05);天枢组、上巨虚组、大肠俞组均低于模型组(P＜0.01);上巨虚组、大肠俞组均高于天枢组(P＜0.01)。6 h内大便重量,模型组低于正常组(P＜0.01);天枢组、上巨虚组、大肠俞组均高于模型组(P＜0.01);上巨虚组、大肠俞组与天枢组比较差异无统计学意义(P＞0.05)。碳推进百分率(%),模型组、大肠俞组(P＜0.01)及上巨虚组(P＜0.05)皆低于正常组;天枢组、上巨虚组、大肠俞组均高于模型组(P＜0.01);大肠俞组碳推进百分率(%)低于天枢组(P＜0.05)。

表1 各组大鼠6 h内首粒黑便排出时间、大便重量及碳推进百分率的比较 (±s)

表1 各组大鼠6 h内首粒黑便排出时间、大便重量及碳推进百分率的比较 (±s)

注:与正常组比较1)P＜0.05,2)P＜0.01;与模型组比较3)P＜0.01;与天枢组比较4)P＜0.05,5)P＜0.01

组别 n 首便时间(min)6 h大便重量(g)百分率(%)正常组 6 195.17±22.36 6.83±1.24 67.94±2.26模型组 7 308.00±28.132) 4.30±0.452) 50.89±6.252)天枢组 7 194.14±14.113) 7.04±0.903) 65.52±5.163)上巨虚组 7 227.14±15.431)3)5) 7.01±0.863) 61.55±3.551)3)大肠俞组 7 233.14±20.602)3)5) 6.83±0.763) 59.94±6.442)3)4)

2.2 穴位埋线对大鼠结肠Cajal间质细胞的影响

正常组相邻Cajal间质细胞呈带状或网络状结构,胞体呈纺锤形或梭形;模型组Cajal间质细胞网络结构被破坏,分布不连续,形态也多异常;经4次穴位埋线治疗后,天枢组、上巨虚组、大肠俞组大鼠结肠Cajal间质细胞的形态分布及网络结构多与正常组接近。模型组与正常组相比,大鼠结肠Cajal间质细胞阳性细胞表达数量明显减少(P＜0.01)。天枢组、大肠俞组(P＜0.01)和上巨虚组(P＜0.05)与模型组相比,大鼠结肠Cajal间质细胞阳性细胞表达数量均明显增加。天枢组与上巨虚组、大肠俞组相比,大鼠结肠Cajal间质细胞阳性细胞表达数量增加较明显(P＜0.01)。大肠俞组与上巨虚组相比,大鼠结肠Cajal间质细胞阳性细胞表达数量增加较明显(P＜0.05)。详见图1、表2。

图1 各组大鼠结肠Cajal间质细胞阳性细胞的变化(免疫组化,×400)

表2 各组大鼠结肠Cajal间质细胞阳性细胞表达的比较(±s)

表2 各组大鼠结肠Cajal间质细胞阳性细胞表达的比较(±s)

注:与正常组比较1)P＜0.01;与模型组比较2)P＜0.05,3)P＜0.01;与天枢组比较4)P＜0.01;与上巨虚组比较5)P＜0.05

组别 n 阳性细胞数(个)正常组 6 67.17±4.96模型组 7 38.86±3.291)天枢组 7 53.86±3.291)3)上巨虚组 7 43.57±2.441)2)4)大肠俞组 7 47.43±2.941)3)4)5)

3 讨论

目前,有关STC的发生机理尚不十分明确,对其发病机制的研究主要集中在肠道形态学的改变和胃肠神经肽的改变方面。近年来,较为统一的研究观点认为Cajal间质细胞在结肠中的分布和功能异常可能是STC结肠慢波频率减慢的直接或间接原因。结肠组织中的Cajal间质细胞的数量、体积和超微结构的改变,引起异常的不规则慢波,由此诱发的动作电位使平滑肌产生不规则的或无效的收缩,使结肠功能紊乱,运转缓慢,粪便通过时间延长,导致慢传输型便秘的发生。研究发现[5],STC患者结肠平滑肌内有大量包涵体形成,而它的出现会导致平滑肌收缩性下降,进而减慢胃肠传输速度。Lee JI等[6]对STC患者乙状结肠标本研究发现,各层组织中ICC数量均减少。林琳等[7]对吗啡诱导的结肠慢传输型小鼠结肠Cajal间质细胞的表达进行观察,发现45 d后实验组小鼠近端结肠组织阳性细胞较对照组显著减少,60 d后吗啡组的阳性细胞较纳洛酮阻断组和对照组显著减少,提示近端结肠Cajal间质细胞的减少可能是结肠慢传输运动的原因之一。

穴位埋线作为目前临床治疗STC的有效方法之一。现代研究表明穴位埋线能改善大肠运动状态,加速对粪便的推进,此作用通过兴奋副交感神经,同时抑制交感神经,增加大肠液分泌,以利于润滑作用;同时还能纠正胃肠道肌电的紊乱状况[8],从而调节胃肠蠕动。穴位作用的特异性是临床配穴及取得疗效的关键,也是针灸研究的热点问题。在临床治疗STC中,我们经常用到的穴位有天枢、大肠俞、上巨虚,而它们对大肠功能有着各自的特异性效应。天枢乃足阳明胃经的腹部要穴及大肠经气所聚集之处,为治疗便秘的重要穴位[9]。天枢为大肠之募穴,腑气之所通。天枢又紧邻脾胃,为气机运行之枢机。大肠俞可补大肠津液而润肠通便,常与天枢俞募相配,相得益彰。上巨虚为大肠经下合穴,根据《灵枢·邪气脏腑病形》“合治内府”理论,故上巨虚穴能治疗大肠疾病,疏导肠腑而治疗便秘,同时它又位于足阳明胃经上,可使胃与大肠共调,增强肠蠕动,使腑气下行,推动肠道内粪便下排。因此,本次研究通过观察穴位埋线对STC模型大鼠肠道传输功能及其结肠组织Cajal间质细胞的影响,来试图探讨穴位埋线治疗STC的可能作用机制及不同穴位调节STC的穴位特异性。在研究中我们发现,天枢、上巨虚、大肠俞对大鼠6 h内首粒黑便排出时间均有改善作用,能显著缩短排便时间,且天枢的作用效果更优于上巨虚和大肠俞(P＜0.01);天枢、上巨虚、大肠俞对大鼠6 h内大便重量有改善作用,能增加大鼠排便重量。天枢组、上巨虚组及大肠俞组对碳推进百分率均有显著改善作用,均能使其得到明显提高(P＜0.01)。但天枢组较大肠俞组在改善程度方面更为明显。模型组Cajal间质细胞网络结构被破坏,分布不连续,形态也多异常,提示Cajal间质细胞的病理改变可能是STC的发病机制之一。经穴位埋线治疗后,天枢组、上巨虚组、大肠俞组大鼠结肠Cajal间质细胞的形态分布及网络结构多与正常组接近,且天枢组与上巨虚组、大肠俞组相比,大鼠结肠Cajal间质细胞阳性细胞表达数量增加较明显(P＜0.01),提示穴位埋线能改善结肠组织中Cajal间质细胞的表达,以达到治疗目的,且不同穴位调节STC存在穴位特异性,特别是天枢更具有明确治疗STC的临床选取应用意义。但穴位埋线是通过何种途径改善STC结肠平滑肌结构及Cajal间质细胞的病理改变,还有待我们进一步的深入研究。

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[7]林琳,姜柳琴,张红杰,等.慢传输运动小鼠结肠组织中Cajal间质细胞的改变[J].胃肠病学,2006,11(8):462-467.

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