脂联素影响骨骼肌胰岛素抵抗模型中葡萄糖转运蛋白4表达的研究

陈 冬，孙 宏，陈明卫，王佑民

(1.安徽省寿县县医院内科，安徽寿县 232200;2.安徽医科大学第一附属医院内分泌科，安徽合肥 230022)

2型糖尿病是慢性炎症性疾病［1］，其病理生理特征主要是胰岛素抵抗(insulin resistance，IR)，胰岛素信号通路受损导致葡萄糖转运蛋白4(GLUT4)转位障碍，目前对GLUT4的研究成为糖尿病发病机制研究中热点之一。近年研究发现，骨骼肌作为一种非传统意义上的内分泌器官，在体内也可表达并分泌一定量的脂联素，体外研究发现分化的L6肌细胞也具有类似的生理效应［2］。研究证实，作为脂肪因子之一的脂联素，和胰岛素抵抗之间有密切的关系［3］，但骨骼肌源性脂联素的调控机制以及在骨骼肌IR发生发展中的地位和作用尚不清楚。本实验通过建立棕榈酸诱导的大鼠L6细胞IR模型，并应用噻唑烷二酮类药物(TZDs)吡格列酮干预，来探讨骨骼肌源性脂联素对骨骼肌IR模型GLUT4表达的影响，以及PPAR-γ激动剂吡格列酮其改善胰岛素敏感性的机制是否涉及激活脂联素。通过本研究，可增加对骨骼肌IR机制的认识，为临床治疗提供一定基础依据。

1 实验材料与方法

1.1 实验细胞与试剂 大鼠L6肌细胞;其他包括高糖DMEM培养基和无酚红DMEM培养基，胎牛血清(FBS)PA及MTT;相关抗体包括兔抗鼠全长脂联素抗体、GLUT4抗体;兔β-actin抗体及辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔抗体和山羊抗鼠抗体;以及化学发光底物试剂盒。

1.2 试验方法

1.2.1 细胞培养和诱导分化 大鼠L6细胞复苏后接种在培养瓶中，在细胞培养箱中，用含10%胎牛血清的高糖DMEM培养液培养。后改用含2%胎牛血清的无酚红DMEM培养基进行诱导分化，至细胞生长出肌管，通过考马斯蓝染色，鉴定肌管形成后，认为大鼠L6细胞诱导分化成熟。

1.2.2 胰岛素抵抗细胞模型的建立 (1)实验分组:将细胞以每孔1×105个的密度接种于96孔培养板，诱导分化为成熟的骨骼肌细胞后，实验分为①对照组(NC组)，即大鼠L6细胞组;②PA诱导组(IR 组)分别用不同浓度的 PA(0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mmol·L-1)进行干预，在细胞培养箱内继续培养，分别收集培养 2、4、8、12、24、36 h 后的细胞上清液，建立胰岛素抵抗组;③胰岛素抵抗模型+吡格列酮组，在建立成功IR组基础上，加用吡格列酮，建立IR+PIO组。(2)MTT法检测棕榈酸对L6细胞活性的影响:L6成肌细胞诱导分化为成熟骨骼肌细胞后，上述PA诱导组中分别加入10-7mol·L-1的胰岛素。每孔加入MTT 10 μL，继续培养4～5 h后，各孔加入DMSO 150 μL，摇床振荡，酶标仪测定492 nm下各组细胞的吸光度，检测棕榈酸对各组细胞活性的影响。(3)葡萄糖消耗试验:用葡萄糖氧化酶—过氧化物酶法测定上述各管上清液中所剩葡萄糖的浓度，同时建立标准管，在490 nm处测定各管吸光度。通过测定管与标准管吸光度的比值，确定上清液残存的葡萄糖浓度，并最终确定胰岛素抵抗模型的建立。(4)Western blot分别检测NC组、IR组和IR+PIO组APN和GLUT4的蛋白表达:用APN和GLUT4灰度值与β-actin灰度值的比值作为APN和GLUT4的相对表达量。

1.2.3 统计学方法 采用SPSS17.0软件对数据进行分析。观测资料主要为计量数据，以(±s)表示，均通过正态性检验。多组间多时点间综合分析为两因素重复测量方差分析;各组间比较采用独立样本t检验;以P＜0.05为有统计学差异。

2 结果

2.1 不同浓度、不同时间的PA对L6细胞活性的影响 MTT结果显示浓度为0.2～0.6 mmol·L-1的PA作用于L6细胞2～36 h后对细胞的活性无影响。而0.8～1.0 mmol·L-1的PA分别作用24、36 h时对细胞的活性有影响，差异有统计学意义(P＜0.05)，见表 1。

表1 不同浓度、不同时间的PA对大鼠L6细胞活性的影响(±s)

表1 不同浓度、不同时间的PA对大鼠L6细胞活性的影响(±s)

注:与NC组比较，*P＜0.05。

作用时间/h组别 剂量/mmol·L-1 49±0.021 0.541±0.015 0.483±0.021 PA诱导组(IR组) 0.2 0.523±0.014 0.518±0.020 0.529±0.017 0.541±0.019 0.540±0.019 0.481±0.018 0.4 0.509±0.020 0.522±0.024 0.532±0.019 0.538±0.017 0.540±0.018 0.478±0.017 0.6 0.521±0.017 0.517±0.018 0.540±0.018 0.541±0.019 0.531±0.017 0.484±0.019 0.8 0.513±0.016 0.528±0.018 0.538±0.018 0.536±0.017 0.497±0.017*0.436±0.018*1.0 0.511±0.017 0.520±0.017 0.535±0.015 0.539±0.018 0.524±0.026*0.465±0.028 12 24 36 NC组 0.0 0.517±0.020 0.521±0.016 0.537±0.018 0.5 2 4 8*

2.2 不同浓度、不同时间的PA对L6细胞葡萄糖代谢的影响 (1)作用2 h后，各组上清液中剩余葡萄糖浓度与NC组相比差异无统计学意义(P＞0.05);(2)作用4 h后，1.0 mmol·L-1PA作用下的细胞上清液葡萄糖浓度明显高于NC组(P＜0.05)，其余浓度的PA组和NC组相比较，无统计学差异(P ＞0.05);(3)作用 8、12 h 后，0.6、0.8、1.0 mmol·L-1PA作用下的细胞上清液葡萄糖浓度明显高于 NC 组(P ＜0.05)，0.2、0.4 mmol·L-1浓度的PA组与NC组相比较，差异无统计学意义(P ＞0.05);(4)作用 24 h 以后，0.4、0.6、0.8、1.0 mmol·L-1PA作用下的细胞上清液葡萄糖浓度较NC组显著升高(P＜0.05)，而0.2 mmol·L-1浓度的PA组与NC组相比较，差异始终无统计学意义(P ＞0.05)。

2.3 三组脂联素及GLT4的Western blot表达水平印迹图 见图1。两两比较显示:(1)与NC组比较，IR组APN、GULT4蛋白表达水平均降低，差异有统计学意义(P＜0.05)(见图2);(3)与IR组比较，IR+PIO组APN、GULT4蛋白表达水平均增加，差异有统计学意义(P＜0.05)(见图3)。

图1 三组APN及GLUT4蛋白表达水平印迹图

图2 NC组和IR组APN和GLUT4蛋白水平表达比较

图3 IR组和IR+PIO组APN和GLUT4蛋白水平表达比较

3 讨论

为研究骨骼肌IR发生机制，建立相关的胰岛素抵抗模型尤为重要。因为胰岛素刺激下的骨骼肌细胞的葡萄糖代谢能力是判断骨骼肌胰岛素敏感性的主要指标，故本研究应用葡萄糖氧化酶—过氧化物酶法(GOD-POD法)检测在不同浓度、不同时间的棕榈酸作用下的L6细胞培养液中残存葡萄糖含量，来评价L6细胞在胰岛素刺激下的葡萄糖摄取和利用能力，即胰岛素敏感性，从而判断是否存在IR，以及IR模型建立成功与否［4］。研究发现，通过对不同时间、不同浓度PA作用后的L6细胞上清液残存葡萄糖浓度测定，显示PA对胰岛素刺激下的骨骼肌细胞的葡萄糖代谢能力有抑制作用。在本研究中，当较高浓度的PA作用于L6细胞达24 h后，MTT方法测定的细胞活性明显降低，提示高浓度棕榈酸长时间刺激可对L6细胞的活性产生抑制作用。由于上清液中葡萄糖浓度的增加，可间接反映胰岛素刺激下的L6细胞的葡萄糖代谢能力的降低，即L6细胞胰岛素敏感性的降低，由此可以认为本研究中PA诱导的大鼠L6细胞IR模型建立成功。实验发现，这种模型的建立与PA的作用浓度密切相关，PA浓度为0.4 mmol·L-1至少24 h后才能建立，而当PA浓度提高至1.0 mmol·L-1时，4 h后即可建立，与国内相关文献报道基本一致［5］。

自1995年Scherer和Lodish首次发现了脂联素的存在，目前相关研究证明，脂联素除在脂肪组织大量表达外，在一些非脂肪组织细胞中也有表达。而对脂肪组织以外脂联素的研究相对较少，其作用机制尚不明确。Krause等［6］证实在大鼠骨骼肌组织以及L6肌细胞中存在脂联素的表达，表达的分布不仅在肌细胞肌膜中，而且在肌细胞的IIA以及IID型肌纤维中也存在。通过对脂联素基因敲除大鼠的进一步研究，发现骨骼肌分泌的脂联素在维持骨骼肌收缩功能以及表型等方面发挥重要作用，初步证明骨骼肌可以通过自分泌的方式分泌脂联素，并在保持骨骼肌细胞功能、脂肪酸β氧化以及葡萄糖摄取等方面发挥重要的作用。本实验发现，无论在NC组还是IR组，应用Western blot方法，均发现L6肌细胞表达脂联素，和国外报道相一致［6］。

与对照组相比，IR组中的L6肌细胞脂联素表达水平明显下降，表明L6肌细胞脂联素表达与骨骼肌IR之间存在内在联系。有关IR状态下骨骼肌源性脂联素下调表达的原因，目前尚不清楚。Coll等［7］研究发现棕榈酸诱导的炎症反应参与了骨骼肌的胰岛素抵抗。相关炎症因子表达增加，抑制骨骼肌细胞内过氧化物酶体增值物激活受体(PPAR)的表达。骨骼肌细胞中脂联素的表达是依赖于PPAR的方式。其中PPAR-γ在葡萄糖代谢中起重要作用。PPAR-γ增加胰岛素敏感性的机制，一个重要的方面就是通过脂联素等信号通路来参与葡萄糖稳态的调节。Lopez等［8］研究表明TZD可直接作用于大鼠骨骼肌L6细胞内PPAR-γ。同时，Hajri等［9］发现在3T3-L1和人体脂肪细胞的培养中，胰岛素可明显增加脂联素的表达和分泌，而TNF-α和IL-6则可强烈抑制这种效应。正是多因素的共同作用，导致在骨骼肌IR模型中，脂联素的表达明显减少。而在骨骼肌IR模型中，加入PPAR-γ激动剂吡格列酮后，脂联素表达水平较前显著增加，与NC组无显著差异，表明骨骼肌源性脂联素的表达是依赖于PPAR-γ的方式。TZD直接作用于大鼠骨骼肌L6细胞内PPAR-γ，从而刺激脂联素的分泌。

关于脂联素增加GLUT4的分泌，目前普遍认为，在骨骼肌中，脂联素首先与脂联素受体1在细胞膜外结合后，刺激脂联素受体结合蛋白1(APPL1)的结合，再激活下游信号传导通路，最终完成增加骨骼肌细胞脂肪酸氧化、GLUT4的表达和膜转位，改善骨骼肌IR等生物学效应。GLUT4是主要的葡萄糖运载体，其所介导的葡萄糖转运是骨骼肌糖代谢的主要限速步骤。GLUT4的这种活性状态的改变与骨骼肌IR密切相关。研究发现［10］脂联素在骨骼肌与其受体结合后，可激活腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)的活性，活化的AMPK可抑制S6激酶(S6K)，进而减弱对胰岛素受体底物1(IRS-1)的负性调节作用，证明脂联素信号通路可能与胰岛素信号通路相互交叉，相互联系。因此，脂联素提高骨骼肌胰岛素敏感性的生物学机制之一可能是通过活化AMPK途径实现，并激活其下游p38MAPK信号通路，增加GLUT4的表达［11］。本研究发现，和对照组比较，在骨骼肌IR模型组中，应用Western blot方法测定的L6细胞源性脂联素表达水平下降，同时L6细胞中GLUT4的表达下降。而在加入PPAR-γ激动剂吡格列酮后，脂联素表达增加，GLUT4表达也同步增加。这种同向改变的趋势，表明L6细胞源性脂联素表达和其GLUT4表达是密切相关的，骨骼肌源性脂联素增加骨骼肌中GLUT4活性，从而可能对骨骼肌IR状态发挥改善作用。

总之，通过本研究发现，大鼠L6细胞株通过培养并分化成熟后，经过棕榈酸的诱导，可以较容易建立大鼠L6细胞胰岛素抵抗模型;大鼠L6细胞可以分泌和表达脂联素，骨骼肌源性脂联素上调L6细胞GLUT4的表达;吡格列酮作为 PPAR-γ激动剂，可增加大鼠L6细胞脂联素的分泌，进而改善胰岛素敏感性。

［1］ 苏佩合，姜 艳，何 岚，等.吡格列酮对2型糖尿病患者血清TNF-α生物学活性及脂联素水平的影响［J］.中国现代医药杂志，2013，15(12):59-62.

［2］ Liu Y，Chewchuk S，Lavigne C，et al.Functional significance of skeletal muscle adiponectin production，changes in animal models of obesity and diabetes，and regulation by rosiglitazone treatment［J］.Am J Physiol Endocrinol Metab，2009，297(3):E657-E664.

［3］ Knights AJ，Funnell AP，Pearson RC，et al.Adipokines and insulin action:A sensitive issue［J］.Adipocyte，2014，3(2):88-96.

［4］ 张召锋，赵 明，王军波，等.肿瘤坏死因子-α诱导大鼠L6细胞胰岛素抵抗模型的建立［J］.卫生研究，2010，39(2):149-151.

［5］ 穆 颖，季爱玲，刘寒强，等.原代培养骨骼肌细胞胰岛素抵抗模型的建立［J］.现代生物医学进展，2008，8(3):433-436.

［6］ Krause MP，Liu Y，Vu V，et al.Adiponectin is expressed by skeletal muscle fiber-s and influences muscle phenotype and function［J］.Physiol Cell Physiol，2008，295(1):C203-C212.

［7］ Coll T，Palomer X，Blanco-Vaca F，et al.Cyclooxygenase 2 inhibition exacerbates palmitate-induced inflammation and insulin resistance in skeletal muscle cells［J］.Endocrinology，2010，151(2):537-548.

［8］ Lopez V，Saraff K，Medh JD.Down-regulation of lipoprotein lipase increases glucose uptake in L6 muscle cells［J］.Biochem Biophys Res Commun，2009，389(1):34-39.

［9］ Hajri T，Tao H，Wattacheril J，et al.Regulation of adiponectin production by insulin:interactions with tumor necrosis factor-α and interleukin-6［J］.Am J Physiol Endocrinol Metab，2011，300(2):E350-E360.

［10］ Vu V，Bui P，Eguchi M，et al.Globular adiponectin induces LKB1/AMPK-dependent glucose uptake via actin cytoskeleton remodeling［J］.J Mol Endocrinol，2013，51(1):155-165.

［11］陈 冬，陈明卫，杨宁宁，等.p38MAPK信号通路对骨骼肌胰岛素抵抗模型 GLUT4表达的研究［J］.安徽医药，2012，16(9):1237-1240.