急性冠脉综合征患者介入术后可视化血液流变性与血小板功能的相关性分析*

王家琪， 刘剑刚， 王承龙

急性冠脉综合征(acute coronary syndrome，ACS)是一组由急性心肌缺血引起的临床综合征，包括急性心肌梗死(acute myocardial infarction，AMI)及不稳定型心绞痛(unstable angina，UA)。中国多省市心血管病危险因素队列研究结果显示，我国急性冠脉综合征的发病率和死亡率均呈快速增长趋势［1］。目前，经皮冠状动脉介入治疗(percutaneous coronary intervention，PCI)是改善ACS临床症状较为有效的方法之一。但是，患者PCI术后康复期间对于康复训练、治疗、健康生活习惯等重视不够而导致新的血管病变时刻影响着患者的远期预后。可视化血液流变性检测仪(micro-channel array flow analyzer，MCFAN)采用半导体技术和仿生技术，可以实时检测血液流动的状况。目前，MC-FAN在国内外已广泛应用于血脂代谢异常、高血压、糖尿病等患者及亚健康人群的血液检测［2-3］。课题组前期应用MC-FAN观测血脂代谢异常的患者，发现高密度脂蛋白与血液通过时间呈负相关［4］，而对ACS介入术后患者的研究还未见报道。氯吡格雷和阿司匹林治疗是抗血小板治疗的基础，也是ACS患者介入术后预防心血管事件的重要手段，ACS患者介入术后的血液流动状况和血小板功能变化如何?是否发生抗血小板药物抵抗?并据此提出合理规范的个体化治疗方案是目前临床面临的新课题。本研究通过MC-FAN观察ACS介入术后一年以上患者可视化血液的流变性，为进一步的临床治疗提供实验室依据。

材料和方法

1 一般资料

选择2008年～2010年因ACS在中国中医科学院西苑医院等13所医院接受介入术治疗后处于稳定期的患者74例，其中男58例，女16例，最大年龄76岁，最小年龄44岁，平均年龄(62.54±7.79)岁。另外选取体检正常21人作为健康对照组，其中男16人，女5人，最大年龄76岁，最小年龄52岁，平均年龄(61.38±7.43)岁。2组间性别、年龄和体重比较，差异无统计学意义(P＞0.05)。

2 诊断标准

ACS诊断标准采用中华医学会心血管病学分会、中华心血管病杂志编辑委员会2007年公布的《不稳定性心绞痛和非ST段抬高心肌梗死诊断与治疗指南》［5］，及2010年公布的《急性ST段抬高型心肌梗死诊断和治疗指南》［6］。

3 纳入及排除标准

除外合并严重肝肾系统、造血系统、神经系统等原发性疾病及精神病、恶性肿瘤患者，有严重认知障碍者，妊娠期或哺乳妇女，需持续机械辅助性治疗的患者，及拒绝签署知情同意书者。健康人均经本院健康体检，并参照《中华医学会老年医学学会对健康老年人标准的建议》［7］纳入。

4 试剂与仪器

血小板聚集诱导剂二磷酸腺苷(adenosine diphosphate，ADP;0.2 mmol/L)为 Biopool International生产;血小板 P-选择素(P-selectin)ELISA试剂盒、血小板衍生生长因子BB(platelet derived growth factor BB，PDGF-BB)ELISA试剂盒和血管假性血友病因子(von Willebrand factor，vWF)ELISA试剂盒由Abcam生产。

MC-FAN(HR300型)由日本MC-FAN研究所生产，北京咸通佳仪科技发展有限公司提供;XSN-RII型血小板黏附测定仪由江苏省无锡电子仪器二厂生产;LBY-NJ2型血小板聚集仪由北京普利生公司生产;Thermo Multiskan MK3型酶标仪由Labsystems生产。

MC-FAN仪是由在硅晶片上制成4 700个6 μm的沟槽来模拟人体毛细血管。将离体肝素抗凝血液放入仪器，仪器以200 mmH2O的恒定压力推动200 μL血液经过模拟人体毛细血管，同时通过彩色显微摄像机将血液通过模拟毛细血管过程中的红细胞变形、白细胞附壁运动、血小板聚集、血小板黏附以及血流和模拟血管的关系等情况放大反映在电脑显示屏上(用实际观测的血液细胞流动图像取代了传统衍射模拟图像)，并且使我们在清晰地看到血细胞流动快慢和变形能力的同时，也动态地记录了10～100 μL血液通过模拟毛细血管的时间［8］。

5M C-FAN检测

采用横断面研究，将ACS介入术后患者作为实验组，健康人作为健康对照组，比较两组间指标检测结果是否存在差异;在实验组内观察血液流变性可视化检测仪测得的血流通过时间(micro-channel array flow analyzer transiting time，MC-FAN TT)与血小板功能指标检测结果是否存在相关性。参与研究者于上午8～10点空腹、静息状态下采集肘静脉血5 mL，1%肝素抗凝全血，室温(25℃)1 h内应用MCFAN观察血液流动情况，并检测MC-FAN TT(单位:s)。

6 血小板功能检测

血小板黏附实验(platelet adhesiveness test，PAdT)采用旋转玻球法，取静脉血2.7 mL，置于含0.129 mol/L枸橼酸钠溶液0.3 mL的真空离心管中，轻轻混匀;立即用微量注射器取血标本1.1 mL，置球形瓶内，将球形瓶置于转动装置上，以3.8 r/min的速度转动15 min，使血液与瓶壁充分接触;分别从真空离心管中(接触前)和球形瓶中(接触后)准确地吸取血10 μL进行血小板计数，血小板黏附率(%)=(血小板黏附前计数－血小板黏附后计数)/黏附前计数×100%;血小板聚集实验(platelet aggregation test，PAgT)采用比浊法，用硅化或一次性注射器从患者肘静脉顺利取血2.7 mL，注入含0.129mol/L枸橼酸钠0.3 mL的真空离心管中;以1 000 r/min离心10 min，取出上层富含血小板血浆(platelet-rich plasma，PRP)，计数血小板并调至250×109/L;将剩余血液以3 000 r/min离心20 min，上层较为透明的液体即为PRP，调节血小板至(10～20)×109/L;将PRP标本放入测定孔调节透光度为10%，并加搅拌磁棒，在37℃预热3 min;在PRP中加入诱导剂，同时开始搅拌(1 000 r/min)，记录聚集波形图，计算机自动计算血小板(1～5 min)最大聚集率;采用ELISA检测血小板P-selectin、PDGF-BB及vWF。

7 统计学处理

应用SPSS 18.0统计软件处理，数据经正态性检验均符合正态分布，用均数±标准差(mean±SD)表示。计量资料采用t检验，计数资料采用χ2检验分析组间关系;采用相关分析及多元线性回归分析，分析血液流经时间的变化与血小板功能指标的相关性。以P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 2组患者基线分析

纳入研究对象共95例，其中ACS介入术后组74例，健康对照组21例。经两独立样本t检验和χ2检验，各组间年龄、性别等基本资料的差异无统计学意义 (P＞0.05)，2组数据具有可比性，见表1。

表1 2组间年龄及性别的比较Table 1.The comparison of age and sex between the two groups

2 ACS介入术后组和健康对照组的MC-FAN结果比较

健康组在 10 μL、30 μL、60 μL 和100 μL 4 个容量(或体积)的血液通过模拟人体毛细血管的时间分别为(6.96 ±1.38)s、(21.71 ±2.82)s、(49.25 ±6.36)s和(80.57 ±5.01)s。与健康组比较，ACS 介入组的红细胞变形能力相对减弱，经MC-FAN测得的血液 MC-FAN TT显著延长，差异有统计学意义(P＜0.01)，见图1和表2。

3 ACS介入术后组和健康对照组的血小板功能指标比较

与健康组比较，ACS介入术后患者的血小板最大聚集率、血小板黏附率、血小板P-选择素和PDGFBB指标均显著升高，差异具有统计学意义(P＜0.01)。2组的vWF所测结果差异无统计学意义(P ＞0.05)，见表3。

4 ACS介入术后患者各血小板功能指标与MCFAN TT的相关性分析

MC-FAN所测10 μL血液 MC-FAN TT与 P-selectin、PDGF-BB、vWF和 PAdT的值呈正相关(P＜0.01)，与 PAgT 的值呈正相关(P ＜0.05);30 μL 血液MC-FAN TT与P-selectin的值呈正相关(P＜0.01)，与 PDGF-BB和 vWF的值呈正相关(P＜0.05);60 μL血液MC-FAN TT与PAgT的值呈正相关(P＜0.01)，与P-selectin和vWF的值呈正相关(P＜0.05);100 μL 血液 MC-FAN TT 与 PAgT 和 PAdT的值呈正相关(P＜0.05)，见表4。

Figure 1.The MC-FAN pictures of acute coronary syndrome(ACS)group and normal group.图1 MC-FAN显示 ACS介入术后患者和正常人群10 μL、30 μL、60 μL和100 μL 血液流动的图像

表22 组MC-FAN TT的比较Table 2.The comparison of MC-FAN TT between the two groups(s.Mean±SD)

表3 2组间血小板功能指标的比较Table 3.The comparison of platelet function indexes between the two groups(Mean±SD)

表4 ACS介入术后患者各血小板功能指标与MC-FAN TT的相关性比较Table 4.The correlations between platelet function indexes and MC-FAN TT in 74 patients with ACS after PCI

以10 μL血液MC-FAN TT为因变量，以P-selectin、PDGF-BB、vWF、PAdT 和 PAgT 的数值为自变量，代入多元线性回归模型，并采用逐步回归法对自变量进行筛选(α入=0.10，α出=0.15)，P-selectin 和PAdT被选入，PAgT、PDGF-BB和vWF被剔除，得出多元线性回归方程为 y=0.72+0.281x1+0.12x2。P-selectin的偏回归系数为0.281，标准回归系数0.626(P ＜0.01)，与10 μL 血液 MC-FAN TT 显著相关(P ＜0.01)。PAdT 的偏回归系数为 0.120，标准回归系数0.272(P ＜0.05)，与 10 μL 血液 MC-FAN TT显著相关(P ＜0.05)。

以30 μL血液MC-FAN TT为因变量，以P-selectin、PDGF-BB和vWF的数值为自变量，代入多元线性回归模型，并采用逐步回归法对自变量进行筛选(α入=0.10，α出=0.15)，P-selectin 被选入，PDGFBB和 vWF被剔除，得出线性回归方程为 y=17.56+0.829x。P-selectin 的偏回归系数为 0.829，标准回归系数0.334(P ＜0.01)，与 30 μL 血液 MCFAN TT显著相关(P ＜0.01)。

以60 μL血液MC-FAN TT为因变量，以PAgT、P-selectin和vWF的值为自变量，代入多元线性回归模型，并采用逐步回归法对自变量进行筛选(α入=0.10，α出=0.15)，PAgT 和 P-selectin 被选入，vWF被剔除，得出多元线性回归方程为y=－11.977+0.916x1+2.263x2。PAgT 的偏回归系数为 0.916，标准回归系数 0.573(P ＜0.01)，与 60 μL血液 MCFAN TT显著相关(P＜0.01)。P-selectin的偏回归系数为2.263，标准回归系数0.495(P ＜0.05)，与60 μL血液MC-FAN TT显著相关(P＜0.01)。

以100 μL血液MC-FAN TT为因变量，以PAgT和PAdT的值为自变量，代入多元线性回归模型，并采用逐步回归法对自变量进行筛选(α入=0.10，α出=0.15)，PAdT被选入，PAgT 被剔除，得出线性回归方程为y=19.252+3.276x。PAgT的偏回归系数为3.276，标准回归系数0.815(P ＜0.05)，与100 μL血液MC-FAN TT显著相关(P＜0.05)。

讨 论

目前，ACS患者的最有效治疗手段之一，即为经皮冠状动脉介入治疗。但是，介入治疗在改善患者心功能的同时，可对靶血管造成一定的损伤［9］，血液流变性的变化被认为是损伤的直接表现之一。由于现有临床研究人群差异较大，支架类型、用药时间及剂量等亦存在差异，个体化治疗方案逐渐成为未来ACS时程选择的方向。应用MC-FAN对ACS介入术后患者的血液流动状态进行检测，可以为个体化方案的制定提供一定参考。对ACS患者进行血运重建可以改善反复发作的心肌缺血，延缓病情进展。但是，术中的导引钢丝通过、球囊扩张及支架释放等过程均可造成血管内膜损伤，激活凝血系统，诱发血液高凝状态;术后缺血再灌注损伤、靶血管直径及残余狭窄程度、支架扩张不完全、支架术后残余狭窄及残余夹层皆可导致血栓形成。早期血栓以及血管内膜平滑肌增生、血小板因子释放等过程促进了介入术后再狭窄的发生。再狭窄形成之后又进一步影响了血液的正常流动，从而引起血小板活化、黏附、聚集，形成晚期支架内血栓。

目前，除缬沙坦预处理被认为对心肌缺血再灌注损伤具有保护作用［10］，并应用于ACS介入术后患者之外，PCI后抗血小板治疗不容忽视。阿司匹林联合氯吡格雷的双重抗血小板治疗被认为是急性冠脉综合征抗血小板治疗的重要基础［11］。根据中华医学会心血管病分会2009年发布的经皮冠状动脉介入治疗指南［12］显示，如无高出血风险，双抗(阿司匹林100mg/d，氯吡格雷75mg/d)至少使用1年。EXCEL生物可降解涂层药物洗脱支架多中心注册研究(Multi-Center Registry of EXCEL BiodegrAdable Drug EluTing StEnt，CREATE)显示，双抗治疗2077例置入生物可降解涂层EXCEL西罗莫司洗脱支架患者6个月与12个月的死亡率分别为0.9%和1.1%，非致死性心肌梗死的发生率为 0.3%和0.4%［13］。Park等［14］对晚期冠状动脉血栓事件相关性和晚期冠状动脉血栓事件评价2个试验进行的汇总分析表明，对于服用双联抗血小板药物已达1年，且在此1年内未发生任何心血管不良事件的患者，继续服用双联抗血小板药物不但不能降低支架内血栓的发生风险，反而使心源性死亡、心肌梗死和卒中复合终点事件的风险呈增加趋势(风险比为1.84，P＜0.05)。

由此可见，现有临床证据相互矛盾，各影响因素差异较大，个体化方案已成为ACS治疗的发展趋势。血小板P-选择素是血小板激活后α颗粒释放的标准，是目前最具有特征性的血小板活化分子标志物，它能直接反映血小板的活化程度;PDGF以α-颗粒的形式存在于血小板中，血小板通过释放功能使PDGF参与上皮细胞增生修复、间质细胞的增生和胶原沉积等过程，故血中PDGF的表达在一定程度上反映了血小板的释放功能，本研究中的PDGF-BB为PDGF的一种亚型，其检测意义与PDGF相同;当内皮细胞受损时，vWF释放入血，可促进血小板黏附、聚集，并参与血栓形成，是反映内皮细胞功能及损伤程度的指标，同时也可以作为反映动脉血栓形成的危险指标。

对于ACS介入术后支架内血栓形成的患者，早期血栓形成的同时，活化的血小板所释放的P-selectin和PDGF可反过来加重血管内膜损伤、调节炎症反应、诱导中膜平滑肌细胞增殖和向内膜下迁移［15］，进而影响血液的正常流动，引起血小板活化、黏附、聚集，或加之抗血小板治疗不当，可促进晚期支架内血栓的形成;而且vWF以复合物的形式参与血栓形成，其水平是影响PCI术后1年主要心血管事件的独立危险因素(P ＜0.01)［16］。在国内，首次应用MC-FAN观测ACS介入术后患者的血液流变情况。本研究测得健康人 100 μL血液的通过时间为(80.57±5.01)s，这与日本静冈县立大学那须惠子等［17］检测的结果基本一致。ACS介入术后患者100 μL 血液的通过时间为(116.61 ±28.56)s，较健康人明显延长。而且在检测过程中可以通过电脑显示器清晰地看到:与健康人比较，ACS介入术后患者血液的红细胞变形能力相对减弱，白细胞附壁及血小板的黏附、聚集相对增多。

本研究测得ACS介入术后患者的可视化血液流变学异常，并且血小板最大聚集率、血小板黏附率、P-selectin和PDGF-BB结果皆较健康组升高，与文献报道基本相符［18］。本研究显示:MC-FAN所测10 μL血液 MC-FAN TT 与 P-selectin、PDGF-BB、vWF、PAdT和PAgT的值存在相关性;30 μL血液MC-FAN TT与P-selectin、PDGF-BB和vWF的值存在相关性;60 μL血液 MC-FAN TT 与 PAgT、P-selectin 和 vWF的值存在相关性;100 μL血液MC-FAN TT与PAgT、PAdT的值存在相关性。这些结果表明，MC-FAN TT与血小板功能存在相关性。其中10 μL血液MCFAN TT和30 μL血液MC-FAN TT与P-selectin的相关性最显著;60 μL血液MC-FAN TT与血小板最大聚集率的相关性最显著;100 μL血液MC-FAN TT与血小板黏附率的相关性最显著，这与血液离体后血小板活化、聚集和黏附的时相顺序相一致。由此可见，ACS介入术后患者的可视化血液流变学变化及血小板功能异常，MC-FAN是直观反映血小板流变情况、客观评价患者血液流动状态的仪器。我们可以通过对ACS介入术后患者的MC-FAN检测结果，更清晰地了解患者血小板的活化程度，从而为临床抗血小板个体化治疗提供参考。同时，我们通过对检测结果的分析，可以更有效预防术后晚期血栓的形成。

［致谢:本课题仪器操作和图像处理得到日本エムシー(MC-FAN)研究所市桥裕一、柳田敏男工程师和北京咸通佳仪科技发展有限公司咸大元、陈亦舟工程师的指导和帮助，谨致谢忱!］

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