不同来源地骨皮药材中地骨皮甲素和乙素及阿魏酸的含量测定分析

赵晓玲 ，张鑫瑶 ，何春年 ，彭 勇

(1．中国医学科学院北京协和医学院药用植物研究所，北京 100193; 2．国家教育部中草药物质基础与资源利用重点实验室，北京 100193)

地骨皮为茄科植物枸杞 Lycium chinense Mill．或宁夏枸杞Lycium barbarum L．的干燥根皮，主产于山西、陕西、宁夏以及华北等地，味甘，性寒，归肺、肝、肾经[1]。地骨皮为常用中药，具有凉血除蒸、清肺降火的功能，用于阴虚潮热、骨蒸盗汗、肺热咳嗽、咯血、内热消渴等症[2]。从20世纪80年代开始，对地骨皮进行了一系列化学成分和药理活性研究，发现其主要成分包括黄酮、有机酸、多肽类、甾醇、香豆素和挥发油等，药理作用主要为降血压、降血糖、解热和镇痛等。然而，迄今地骨皮有效成分尚不明确，《中国药典》也没有含量测定项[3]。为了更好地控制地骨皮药材质量，本试验对地骨皮中有较明确药理活性的地骨皮甲素/乙素和阿魏酸两类化合物进行含量测定研究。

地骨皮甲素和地骨皮乙素(结构见图1)属于精胺生物碱。地骨皮甲素、乙素体外可以从源头阻断细胞的炎症活化，避免免疫反应紊乱，体内可对脂多糖和CpG DNA发挥拮抗作用，因此地骨皮甲素、乙素是纠正免疫紊乱、发挥防止脓毒症和自身免疫性疾病作用的重要物质基础[4];另外，还具有锥虫基硫还原酶抑制[5]和细菌内毒素拮抗[6]等活性。地骨皮甲素和乙素同时存在于中药地骨皮中，是主要的降血压有效成分[7];两者系同分异构体，在常规色谱条件下难以分离[8-9]。同时，两者药理活性均非常明显，因此在本试验中作为同一指标进行测定。

图1 化学结构式

阿魏酸(结构见图1)是植物中广泛分布的一种芳香酸，具有抗血小板聚集、抑制血小板5-羟色胺释放、抑制血小板血栓素A2的生成[7]、增强前列腺素活性、镇痛、缓解血管痉挛等作用[8]。因此，在本试验中采用高效液相色谱-二极管阵列检测器(HPLC-DAD)法同时测定了不同来源地骨皮药材中地骨皮甲素、乙素和阿魏酸含量，比较分析其含量在该药材中存在的一般规律，以期为该药材的质量控制、评价以及资源开发利用等提供一定依据。

1 仪器与材料

Agilent 1200型高效液相色谱仪，包括 G1322A型在线脱气机、G1311A型液相泵、G1329A自动进样器、G1316A柱温箱、G1315B型DAD检测器、Agilent色谱工作站;UV2550型紫外光谱仪(日本岛津公司);AL204型梅特勒-托利多电子天平;DTC-21型ULVAC薄膜真空泵;C9860A型超声波清洗器(上海杰恩普超声设备有限公司)。色谱纯为乙腈(美国Honeywell B＆JACS公司)，实验用水为娃哈哈纯净水;其他试剂均为分析纯。地骨皮乙素对照品(批号为12021708)、阿魏酸对照品(中国药品生物制品检定所，批号为100519)。地骨皮药材包括笔者采集的来源于野生和栽培的品种及购自全国各大药店的样品，经北京协和医学院药用植物研究所彭勇研究员鉴定为枸杞 Lycium chinense Mill．或宁夏枸杞 L．barbarum L．的干燥根皮。

2 方法与结果

2．1 色谱条件

色谱柱:Synergi 4u Hydro-RP 80A柱(250 mm ×4．6 mm，4 μm);流动相:乙腈(A)-0．5%三氟乙酸水溶液(B)，梯度洗脱，0～3 min时 10%A，3～10 min时 10% ～12%A，10～20 min时12% ～14%A，20～35 min时 14% ～15%A;流速:1．0 mL/min;柱温:30℃;检测波长:278 nm;进样量:10 μL。色谱图见图2。

图2 高效液相色谱图

2．2 溶液制备

精密称取地骨皮甲素对照品13．67 mg、地骨皮乙素对照品27．34 mg，阿魏酸对照品 2．30 mg，分别置 1，10 mL 容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，得每1 mL含地骨皮甲素13 670 μg、地骨皮乙素27 340 μg和阿魏酸230 μg的对照品溶液。取本品粉末约1．5 g，精密称定，置30 mL西林瓶中，加甲醇15 mL，冷浸1 h，40℃超声处理1 h，静置，放冷至室温，滤过，用10 mL甲醇分2次洗涤残渣，过滤，合并两次滤液，蒸干;残留物用甲醇分次溶解，转移至2 mL容量瓶中，并定容置刻度，摇匀，过0．45 μm微孔滤膜，即得供试品溶液。

2．3 方法学考察

线性关系考察:取地骨皮乙素对照品溶液，将其依次稀释成质量浓度分别为 27 340．0，13 670．0，1 367．0，273．4，136．7 μg/mL，将阿魏酸对照品溶液依次稀释成质量浓度分别为230．0，57．5，23．0，11．5，4．6 μg/mL，按拟订色谱条件测定，记录色谱图。以进样质量浓度为横坐标、峰面积为纵坐标绘制标准曲线，得回归方程，地骨皮乙素为 Y=2．462 2X-329．607 3，r2=0．999 5(n=5)，阿魏酸为 Y=23．5955X-5．8775，r2=1．0000(n=5)。结果表明，地骨皮乙素与阿魏酸质量浓度线性范围分别为136．7～27340μg/mL和 4．6 ～230 μg/mL。

精密度试验:精密吸取供试品(32号样品)溶液，按拟订色谱条件，连续进样6次，记录峰面积。结果地骨皮乙素与阿魏酸峰面积积分值的 RSD分别为0．54%和0．92%，表明仪器精密度良好。

重复性试验:取32号地骨皮样品粉末1．5 g，共6份，精密称定，依法制备供试品溶液，按拟订色谱条件检测。结果地骨皮乙素和阿魏酸峰面积积分值的 RSD分别为1．61%和1．05%(n=6)，表明方法重复性良好。

稳定性试验:精密吸取供试品(32号样品)溶液，室温下，分别于制样后 0，2，4，8，12，24 h 时按拟订色谱条件进样检测。结果地骨皮乙素和阿魏酸峰面积的 RSD分别为 0．65% 和2．23%(n=6)，表明供试品溶液中地骨皮乙素和阿魏酸在24 h内稳定。

加样回收试验:取已知含量的32号地骨皮样品各9份，每份约1．5 g，精密称定，分别加入定量地骨皮乙素和阿魏酸对照品，依法制备供试品溶液，测定样品中地骨皮乙素和阿魏酸含量，计算加样回收率。结果见表1。

表1 加样回收试验结果(n=9)

2．4 样品含量测定

精密吸取各批次供试品溶液10 μL，按拟订色谱条件进样，以外标法计算样品中地骨皮乙素和阿魏酸的含量，结果见表2。可见，在野生的8个 L．chinense样品中，山西、陕西和宁夏的样品1，2，3，5，6 号中地骨皮乙素含量较高，均不低于 8．969 mg/g，但阿魏酸含量不一，含量最低值8．602 μg/g出现在5号的山西样品中;在3个栽培的 L．barbarum样品中，地骨皮乙素的含量均相对较高，介于9．090～15．026 mg/g，而阿魏酸含量则处于中等偏下水平，均小于11．292 μg/g;在市售的33个样品中，产地为安徽、内蒙古和湖南的 12，13，14，33，34，41，42 号样品中地骨皮乙素的含量均在1 mg/g以下，含量相对较低，呈现了一定的地域规律，除两个北方的内蒙样品外，其他均为南方购买药材，而阿魏酸含量则介于 10．208 ～34．336 μg/g，无明显的地域差异。分析L．chinense和 L．barbarum这两个种间的地骨皮乙素和阿魏酸含量，L．chinense中地骨皮乙素的含量相对偏高，除了上述提到的地域差别外，只有17，20，25号样品中地骨皮乙素含量低于5 mg/g;而 L．barbarum中除38号样品地骨皮乙素的含量为8．609 mg/g外，其他样品的含量均低于5．021 mg/g，两个种间阿魏酸含量的4 个最高值都出现在 L．chinense样品中，分别是 27，32，36，37 号样品。

表2 样品中阿魏酸含量测定结果(n=3)

3 讨论

本试验采用了不同比例的甲醇、乙醇为提取溶剂进行超声提取，发现甲醇提取的粗提物中杂质峰相对较少;考察了不同流动相及添加酸水种类，发现以乙腈和含0．5%三氟乙酸作为流动相检测，地骨皮乙素和阿魏酸色谱峰分离度好，无干扰，因此选择乙腈-0．5%三氟乙酸水系统进行梯度洗脱。此外，本试验也比较了不同检测波长，发现在278 nm波长处地骨皮乙素具有最大吸收，同时阿魏酸也有较好的分离度且峰形较好，可较准确地测定含量，因此选择278 nm作为检测波长[10]。

本试验测定的地骨皮甲素、乙素和阿魏酸各有其特有的生物活性。地骨皮甲素是锥虫基硫还原酶的有效抑制剂[4]，地骨皮乙素是一种新型的天然抗败血症剂[11]，且两者在地骨皮中的含量较大;而阿魏酸作为一种化感物质，在根内可以表现出抑制竞争性植物生长的作用[12]，在枸杞栽培的过程中可能会产生一定的影响。此外，地骨皮甲素和乙素两者系同分异构体，紫外检测条件下在同一保留时间出峰(见图2)[8-9]。鉴于此，本试验在前期准备中利用紫外分光光度计测定并计算相同条件下两者的摩尔吸光系数 ε，分别为 1．69 ×105L/(mol·cm)和 1．68 ×105L/(mol·cm)，两者差别不大。如图2所示，在购买到的对照品中地骨皮甲素的纯度只有85%，因此本试验将地骨皮甲素和乙素作为一个指标，以地骨皮乙素作对照品进行成分含量的共同标定，试验结果证明该方法是可行的。结合含量测定结果，将地骨皮甲素、乙素作为地骨皮质量控制的特征性指标是合适的，且地骨皮中地骨皮甲素、乙素以地骨皮乙素计，含量不应低于1 mg/g。

[1]国家药典委员会．中华人民共和国药典(一部)[M]．北京:中国医药科技出版社，2010:115．

[2]周兴旺，徐国钧，王 强，等．常用中药材品种整理与质量研究(南方篇)[M]．福州:福建科学技术出版社，1988:656-676．

[3]陈远良．地骨皮等6种中药饮片伪品的鉴别[J]．中国药业，2009，18(18):77-78．

[4]郑 江，刘 鑫，郑新川，等．苦柯胺A和苦柯胺B的用途:中国，201010156503[P]．2011-11-03．

[5]Ponasik JA，Strickland C，Faerman C，et al．Kukoamine A and other hydrophobic acylpolyamines:potent and selective inhibitors of Crithidia fasciculata trypanothione reductase[J]．Biochem．J．，1995，311:371-375．

[6]杨景程，刘 鑫，郑新川，等．苦柯胺B拮抗细菌内毒素和CpG DNA的实验研究[J]．第三军医大学学报，2012，34(11):1 062-1 066．

[7]余竞光．中药地骨皮的降血压成分——新生物碱地骨皮甲素[J]．国外医学:药学分册，1981(1):6．

[8]Funayama S，Yoshida K，Konno C，et al．Structure of Kukoamine A，a hypotensive principle of Lycium chinense root barks[J]．Tetrahedron Lett，1980，21(14):1 355-1 356．

[9]Funayama Shinji，Zhang Gui-Rong，Nozoe Shigeo．Kukoamine B，a spermine alkaloid from Lycium chinense[J]．Phytochemistry，1995，38(6):1 529-1 531．

[10]刘 翔，曹云飞，窦金凤．不同产地旱墨莲中木樨草素含量测定[J]．中国药业，2007，16(23):12-13．

[11]Liu X，Zheng X，Long Y，et al．Dual targets guided screening and isolation of Kukoamine B as a novel natural anti-sepsis agent from traditional Chinese herb Cortex lycii[J]．Int Immunopharmacol，2011，11(1):110-120．

[12]Ben-Hayyim G，Damon JP，Martin-Tanguy J，et al．Changing root system architecture through inhibition of putrescine and feruloyl putrescine accumulation[J]．FEBS Lett，1994，342(2):145-148．