体外扩增自体脂肪干细胞对空鼻综合征患者黏膜功能重建的临床研究

李梁，贾德进，闫俊灵，陈冲，丁红，汤苏阳

空鼻综合征(empty nose syndrome，ENS)是一种由鼻-鼻腔手术切除引起的医源性鼻生理功能慢性衰退性疾病。文献显示，下鼻甲切除后约有20%的患者会发展为ENS[1-2]。ENS主观感觉的严重程度与客观检查不平行，很容易引发医患矛盾；令人痛惜的“温岭杀医血案”、“北大袭医案”都是由此病而引发的。建立ENS的诊断标准，阻断ENS的发生发展，缓解ENS的临床症状是当前亟须解决的问题。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选取2013年8月－2014年2月在武警总医院皮肤再生医学科、耳鼻喉科就诊的ENS患者，经SCL-90自评症状量表心理测试(250分以下)、焦虑自评量表测试(中度以下)及抑郁自评量表测试(中度以下)，筛选出5例患者，其中男4例，女1例，年龄22～30岁，平均26岁，健康状况良好，无其他系统性疾病，均为双侧鼻腔手术后继发ENS。其中3例ENS患者有鼻甲残留，2例无鼻甲残留。主观症状：鼻黏膜干燥，通气过度，吸气干冷，睡眠质量差。治疗前均行鼻内镜检查、鼻腔鼻窦结局测试20条(sino-nasal outcome test -20，SNOT-20)问卷调查[1-2]、鼻声阻力和鼻黏膜纤毛清除功能测定。所有患者均签订知情同意书，并经武警总医院伦理委员会批准。

1.2 方法

1.2.1 自体脂肪干细胞(adipose tissue-derived stromal cells，ASCs)制备 入选患者行血液常规检查及传染病抗原抗体检测(包括各项肝炎、梅毒、艾滋病抗体)。从患者下腹部和大腿通过吸脂手术抽取脂肪15～20ml，经终浓度0.1%Ⅰ型胶原蛋白酶、胰酶消化、离心，去除脂肪及上清液，重悬沉淀，经200目细胞筛过滤，再次离心，经红细胞裂解液裂解红细胞、磷酸盐缓冲液洗涤2次，所得细胞提取物用含15%胎牛血清的高糖DMEM培养液重悬，以适当密度接种于无菌培养瓶中，4～5d后加液，之后每3d换液1次，待原代细胞达85%融合，用0.05%胰蛋白酶消化，按照1:2比例传代。传至第3代(P3)时按《中华人民共和国药典》2010年版三部附录ⅫA无菌检测法进行检测，采用全自动微生物培养检测系统检测支原体、人源特定病毒、猪源病毒、内毒素，结果均呈阴性；细胞形态及活性观察、染色体核型分析、ASCs免疫表型鉴定结果均显示无异常。

1.2.2 ASCs联合脂肪颗粒移植鼻甲成形术 对有鼻甲残留的3例ENS患者，在鼻甲黏膜受损处进行ASCs注射移植，隔10日1次，共4次；对无鼻甲残留的2例ENS患者，在鼻黏膜受损处进行ASCs注射移植，隔10日1次，3次后，抽取其自体单纯脂肪颗粒1～5ml，与1×107～5×107个第3～6代ASCs混合后，行鼻内镜下鼻甲或中鼻甲成形术。治疗后3、6、9个月分别行鼻内镜检查、SNOT-20问卷调查、鼻声阻力鼻黏膜纤毛清除功能测定。

1.3 统计学处理 采用SPSS 19.0软件进行统计学分析，数据结果以表示，组间比较采用单因素方差分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 临床表现 5例ENS患者ASCs联合脂肪颗粒移植鼻甲成形术后未出现感染、过敏等症状。4例患者主观症状明显改善，自感鼻黏膜湿润，通气时黏膜的紧绷感消失，吸气时鼻腔疼痛症状消失，睡眠质量明显改善。1例患者鼻黏膜干燥症状明显改善，但通气过度症状仍存在。

2.2 鼻内镜检查 鼻内镜下可见治疗后3个月鼻黏膜较治疗前颜色红润，黏液分泌增多，硬痂减少(图1)。

2.3 SNOT-20评价 统计学分析显示，治疗前5例患者SNOT-20问卷总分与治疗后3、6、9个月比较差异有统计学意义(P＜0.05)，干燥、鼻空、入睡困难项得分治疗前与治疗后比较差异有统计学意义(P＜0.05)，患者这3个症状有明显改善。其他因素治疗前的症状不明显，得分低，治疗后与治疗前比较差异无统计学意义(P＞0.05，表1)。

2.4 鼻声阻力与黏膜纤毛清除功能测定结果 与治疗前相比，5例患者鼻甲成形术后鼻阻力有所增加，鼻腔容积及鼻腔最小横断面积有所减少，鼻黏膜纤毛清除功能有所改善，但差异均无统计学意义(P＞0.05，表2)。

3 讨 论

ENS常发生于鼻-鼻腔手术后数月到数年，其诊断主要依靠患者的症状、体征以及既往手术史。国外学者认为鼻黏膜面积减少[3]、鼻阻力改变共同参与了ENS的发生。鼻黏膜分布有腺体、感受器等，具有加温、加湿、免疫、清洁等作用，鼻部特有的解剖结构形成鼻阻力，可调节鼻腔气流及层流状态，ENS患者上述功能衰退，影响了其正常的工作与生活。

目前在鼻-鼻腔手术中尽可能保护鼻黏膜、预防ENS的发生已经成为耳鼻喉科医生的共识。临床上常采用羟基磷灰石、自体软骨[4]、多孔聚乙烯、Gore-Tex、脱细胞真皮等植入ENS患者鼻黏膜下，用以改善鼻阻力及鼻腔通气状况，具有一定的治疗效果，但上述方法对ENS黏膜功能恢复的作用尚不明确。

图1 鼻甲成形术前后鼻黏膜情况比较Fig. 1 Nasal turbinate after angioplasty compared to the situation

表1 治疗前和治疗后3、6、9个月SNOT-20问卷得分比较(，n=5)Tab.1 Before treatment and after 3, 6, 9 months SNOT-20 questionnaire scores compare s, n=5)

表1 治疗前和治疗后3、6、9个月SNOT-20问卷得分比较(，n=5)Tab.1 Before treatment and after 3, 6, 9 months SNOT-20 questionnaire scores compare s, n=5)

(1)P＜0.05 compared with before treatment

Item Before treatment After treatment (month)3 6 9 Need to blow nose 1.9±1.7 1.1±1.3 1.3±0.9 1.2±0.2 Sneezing 1.0±1.1 0.8±1.2 0.5±0.6 0.3±0.2 Runny nose 0.6±1.1 0.5±0.7 0.5±0.5 0.5±0.3 Cough 1.4±1.7 1.2±1.6 0.8±1.3 0.5±0.2 Postnasal discharge 2.5±1.9 1.3±2.1 1.0±1.6 0.4±0.3 Thick nasal discharge 0.8±1.3 0.5±0.2 0.6±0.9 0.3±0.3 Ear fullness 0 0 0 0 Dizziness 1.5±1.2 0.8±0.7 0.9±0.5 0.3±0.3 Ear pain 0 0 0 0 Facial pain/pressure 1.5±0.9 0.5±0.6 0.6±0.5 0.5±0.4 Difficulty falling asleep 4.3±2.3 2.2±2.4(1) 2.0±1.8(1) 0.7±0.3(1)Waking up at night 4.0±2.1 2.0±1.8 1.9±1.2 1.0±0.3 Lack of good night's sleep 3.5±2.1 1.3±2.0 1.4±1.3 0.7±0.4 Waking up tired 3.3±1.9 1.5±1.9 1.2±1.6 1.1±0.3 Fatigue 3.6±1.7 1.5±1.9 1.3±1.2 1.3±0.3 Reduced productivity 3.7±1.9 1.5±2.1 1.4±1.3 1.3±0.4 Reduced concentration 3.9±1.5 1.8±2.0 1.3±1.3 1.4±0.3 Frustration/restlessness/irritability 2.8±1.5 1.1±1.8 1.2±1.0 0.8±0.5 Sadness 3.0±1.6 1.2±1.5 1.1±1.3 1.0±0.4 Embarrassment 2.9±1.8 1.4±2.1 1.4±1.6 1.4±0.5 Dryness 4.5±1.3 2.5±1.2(1) 0.5±0.6(1) 0.5±0.1(1)Difficulty with nasal breathing 2.1±1.5 1.0±0.9 0.6±0.7 0.4±0.2 Suffocation 1.5±1.5 0.2±0.3 0.3±0.6 0.3±0.2 Nose is too open 4.0±2.0 2.0±0.9(1) 1.5±1.2(1) 0.6±0.3(1)Nasal crusting 3.1±1.8 1.5±0.4 1.2±0.5 0.5±0.2 Total score 50.1±18.7 22.6±15.8(1) 20.4±18.9(1) 17±6.9(1)

表2 鼻声阻力、鼻黏膜纤毛清除功能治疗前、后比较±s，n=5)Tab.2 Nasal sound resistance, nasal mucociliary clearance function before and after treatment ±s, n=5)

表2 鼻声阻力、鼻黏膜纤毛清除功能治疗前、后比较±s，n=5)Tab.2 Nasal sound resistance, nasal mucociliary clearance function before and after treatment ±s, n=5)

Item Before treatment After treatment (month)3 6 9 NAR (cmH2O/L/Mi) 1.02±0.60 1.23±0.25 1.19±0.45 1.32±0.63 NV (cc) 20.03±3.85 15.25±1.45 16.84±2.307 16.34±1.82 MCA (cm2) 0.71±0.10 0.55±0.65 0.59±0.45 0.50±0.13 MCC (s) 1526.23±1000.43 1457.13±1078.23 1232.03±499.45 1501.00±1159.85

本研究采用ASCs联合脂肪颗粒移植进行鼻内微创鼻甲成形术治疗ENS，取得了较好的效果。ASCs具有来源广泛、取材容易、损伤小、增殖迅速、表型稳定、低免疫原性、遗传稳定等特点，并有向中胚层的脂肪细胞、成骨细胞、软骨细胞、血管内皮细胞、表皮细胞等分化的潜能。体外扩增的ASCs能提高移植脂肪细胞的成活率，促进移植脂肪的血管再生，降低脂肪颗粒吸收、液化及感染的发生率，一次移植成形效果较好[4-6]。本组5例患者黏膜重建手术后鼻腔干燥、矛盾性鼻阻[7]症状明显改善。矛盾性鼻阻是指患者主观感觉鼻塞，但与鼻腔检查发现鼻腔容积足够或过于宽大的结果不相符[8]。此外，本组患者治疗后鼻黏膜对冷空气的加温、加湿作用明显改善，吸气时鼻腔及面部疼痛症状消失，睡眠质量明显改善。该结果表明ASCs联合脂肪颗粒移植进行鼻内微创鼻甲成形，重建了ENS患者的鼻黏膜，恢复了鼻甲黏膜面积和鼻腔正常生理功能。本研究采用体外培养扩增的第3～6代ASCs，具有免疫表型及遗传性状稳定，分化潜能好的优点。移植时将1×107个ASCs与1ml脂肪颗粒混合，ASCs以脂肪颗粒细胞为支架行增殖分化，而ASCs分泌的细胞因子、基质能提高移植后脂肪细胞的成活率，二者发挥协同作用，从而起到促进鼻甲成形、增加鼻黏膜面积的作用。

本研究在5例ENS患者中进行了ASCs联合脂肪颗粒移植鼻甲成形术，结果显示该方法效果较好，但由于随访时间短、样本量小等不足，还需要更深入的研究来充分证实其临床疗效及作用机制。

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