光强对微囊藻群体形态的影响及其生理机制研究

肖 艳 甘南琴 郑凌凌 宋立荣

(1. 中国科学院重庆绿色智能技术研究院, 三峡生态环境研究所, 重庆 401122; 2. 中国科学院水生生物研究所, 武汉 430072)

在富营养化湖泊中, 蓝藻水华的频繁暴发引起水生态系统结构和功能的损害, 并对人类健康造成潜在威胁[1]。其中, 微囊藻常在我国大多数的浅水湖泊中聚积成很大的群体并形成有害水华。通常在培养条件下, 微囊藻以单细胞形式存在, 而在自然条件下主要是以群体形式存在[2]。许多研究认为, 这种表型可塑性, 即一种基因型在不同的环境条件下呈现出多种表型的现象, 是对环境的适应。这种适应使得微囊藻更能应对和抵御外界环境的变化, 从而形成了极强的生态竞争优势, 如群体微囊藻对低磷的耐受能力比单细胞微囊藻强[3], 并具有高效的无机碳吸收能力[4,5], 抗高光强辐射和Cu胁迫的能力[6,7],较快的迁移速率[8], 且能更好地抵御捕食压力[9]。

目前研究认为, 环境条件的变化导致了藻类形态的改变。因此, 要了解这种形态改变的机制, 也就需要了解外界各种环境因素对藻类的影响。已有研究表明环境中的非生物因子, 如光照、温度、pH、微量元素、微囊藻毒素(Microcystins, MCs)等[10—13],及生物因素, 如细菌、浮游动物等[14,15]都能对浮游植物的形态产生影响。光是所有光合自养生物的重要资源, 它的可利用性可以影响种群结构[16]。Naselli-Flores, et al.[17]也指出在富营养化水体中,光照是浮游植物形成聚集体的重要因素。

目前有关光照对微囊藻形态影响的研究相对较少, 且一般都建立在单细胞形态的基础之上, 已有研究表明单细胞和群体微囊藻在生理参数及对胁迫的响应上具有明显的差异[3,18]。深入研究微囊藻水华形成及优势维持, 对微囊藻群体的研究尤显重要。基于此背景, 本研究选取 6株不同种的群体微囊藻, 深入探讨光强对群体微囊藻的形态、群体大小的影响及其生理机制。

1 材料与方法

1.1 藻种及培养条件

实验选用的群体微囊藻相关信息见表 1。Microcystis flos-aquae FACHB1174和M. sp. FACHB1027取自中国科学院水生生物研究所淡水藻种库(FACHB-collection); M. wesenbergii DC-M1、M.viridis DC-M2、M. aeruginosa TH-M2 和 M.aeruginosa DH-M1分别分离自滇池(DC)、太湖(TH)和东湖(DH), 在显微镜下挑取单克隆, 无菌纯化培养, 并保存于中国科学院水生生物研究所淡水藻种库。这 6株微囊藻都保持群体形态, 直径大小100—600 μm不等。常规培养以BG11为基础培养基,培养温度(25±1)℃, 光照强度 25 μmol/(m2·s), 光周期 12h︰12h。当藻培养至对数期时, 离心后加入新鲜的培养液转入250 mL三角瓶中, 放在实验设置的光强梯度 0、10、25、80、120 和 200 μmol/(m2·s)下培养。实验周期为 15d, 光强 25 μmol/(m2·s)为对照组。

表1 本实验所用群体微囊藻藻株Tab. 1 Strains of colonial Microcystis used in this study

1.2 群体大小的测定

微囊藻的群体大小通过装有数码相机(Olympus DP 71)的显微镜拍照测定(Olympus BX 51, Japan)。随机取样 50个群体微囊藻, 在图片测量分析软件Olympus DP-Soft中量取单个群体微囊藻的面积(S)、长(l)、宽(d)等指标, 通过公式换算成近似球体直径(即群体直径)[19,20], 并求平均值。

1.3 比生长速率的测定

采用细胞计数法每3天测定一次生物量。生长速率根据一定时间内细胞数量的变化来计算[21]。群体微囊藻用超声波打散为单细胞再进行细胞计数,超声功率100W, 超声时间3s, 间隔3s, 全程1min。

1.4 胞外及胶被多糖的测定

每3天取不同光强条件下的藻样, 8000 r/min离心10min (Eppendorf, 5804R, Germany), 上清液进行溶解性胞外多糖的测定。藻细胞沉淀重悬于等体积的超纯水中, 50℃水浴加热并不断搅拌30min, 离心取上清进行胶被多糖含量的测定[22]。多糖含量与细胞数的比值可定义为单位生物量内多糖的含量。

1.5 微囊藻毒素合成酶基因(mcy)表达的检测

取群体微囊藻样品 20 mL, 8000 r/min离心10min收集藻细胞。总RNA的提取使用Trizol试剂盒(Invitrogen, USA)。RNA纯化使用RNeasy试剂盒(QIAGEN, Hilden, Germany)。随后通过电泳检测RNA的完整性, 测定 A280、A260判断其质量, 检测RNA浓度(Nano-drop Technologies, Wilmington, DE,USA)并稀释一致。

纯化并稀释后的总 RNA用逆转录试剂盒(Invitrogen, USA)以随机引物oligo(dT)18进行逆转录成cDNA。以cDNA作为模板, 用特异的基因引物[23]进行PCR反应检测基因的转录。PCR反应条件如下:20 μL反应体系中含有 2 μL 10倍缓冲液, 0.2 μL dNTP, 0.2 μL Taq DNA polymerase, 引物各 0.5 μL,1.5 μL cDNA, 15.1 μL ddH2O。反应经 94°C 5min 变性后, 进行 32个循环: 94℃ 30s, 55℃ 30s, 72℃30s, 最后在72℃延伸5min。使用Mastercycler pro(Eppendorf, Germany) PCR仪进行扩增。PCR产物在1.4%琼脂糖凝胶电泳检查。选用16S rRNA作为内参, 因为 16S rRNA基因在不同环境条件下表达都相对稳定[24]。

1.6 胞内微囊藻毒素含量的测定

取藻样30 mL, 经0.45 μm醋酸纤维滤膜抽滤后冷冻干燥处理。将藻样(包括滤膜)用75%甲醇提取3次后合并提取液(最后约100 mL)。旋转蒸发浓缩去除甲醇(最后体积约 10 mL), 然后将浓缩提取液用SPE柱浓缩富集、洗涤、洗脱, 最后定容至1 mL, 高速离心(12000 r/min, 10min)后, 在高压液相色谱仪(High-Performance Liquid Chromatography, HPLC)上进行测定[25]。毒素含量与细胞数的比值可定义为单位生物量内毒素的含量。

1.7 数据分析

所有实验重复3次, 数据用平均值±标准偏差表示。数据分析采用 Origin Version 8.0 (Origin Lab Corporation, USA)方差分析和组间差异显著性检验(One-way ANOVA), 当P<0.05时, 处理组与对照组间存在显著性差异。

2 结果

2.1 不同光强对微囊藻群体大小的影响

对不同光强下群体大小测定的结果显示(图 1),当光强为 80—200 μmol/(m2·s)时, 6 株微囊藻群体直径显著增加(P<0.05)。在 200 μmol/(m2·s)的光照条件下, 微囊藻的群体直径最大, DH-M1、DC-M2、TH-M2、DC-M1、FACHB1174和FACHB1027的群体直径比对照组分别增大了2.4、1.8、1.9、1.7、1.9和 3.9倍。在光强低于25 μmol/(m2·s)及黑暗条件下,6株微囊藻的群体直径略有减小。

图1 不同光强下微囊藻群体大小的变化Fig. 1 Change of size of Microcystis colonies at different light intensities

2.2 不同光强对群体微囊藻比生长速率的影响

结果表明, 当光强在 80 μmol/(m2·s)以下时, 6株群体微囊藻的生长速率随着光强增加而稳定增大。在光强为 80—200 μmol/(m2·s)时, TH-M2、DC-M1、FACHB1174和FACHB1027这4株群体微囊藻, 生长速率变化无显著性差异(P>0.05); 而 DH-M1和DC-M2在高光强下比生长速率显著增大(P<0.05),在光强为 200 μmol/(m2·s)时生长最快, 生长速率分别达到0.22/d和0.19/d。此外, 在黑暗条件下, 6株群体微囊藻的生长都受到抑制(图2)。

2.3 不同光强对群体微囊藻胞外及胶被多糖含量的影响

群体微囊藻 TH-M2、DC-M1、FACHB1174和FACHB1027 在高光强 120 和 200 μmol/(m2·s)下的胞外多糖含量显著高于 25—80 μmol/(m2·s)的处理组含量(P<0.05), 在 200 μmol/( m2·s)条件下, 单位生物量胞外多糖含量比对照组(25 μmol/(m2·s))分别增加了 2、1.9、2、2.4 倍。而另 2 株微囊藻 DH-M1、DC-M2在光强为 25—200 μmol/(m2·s)时, 单位细胞胞外多糖含量变化无显著性差异(P>0.05), 保持在较低水平(图 3A)。与此同时, 胶被多糖含量的变化与胞外多糖含量的变化呈现相同的趋势(图3B)。

2.4 不同光强对群体微囊藻毒素合成酶基因(mcy)表达含量的影响

图2 不同光强下群体微囊藻的比生长速率Fig. 2 The specific growth rates of Microcystis at varying light intensities

在24h内, 3株群体微囊藻在不同光强条件下的mcyB和mcyD转录水平已有明显变化。随着光照的增加, TH-M2的mcyB的转录水平无明显差异,而 mcyD的水平在高光强下升高。另两株DC-M2、FACHB1027的mcyB和mcyD转录水平都有明显上升。光照越强, mcyB和mcyD的转录水平越高, 在 200 μmol/(m2·s)时达到最大(图 4)。

2.5 不同光强对群体微囊藻胞内毒素含量的影响

实验所用的 6株群体微囊藻除 M. wesenbergii DC-M1外, 其余 5株微囊藻经检测都产毒。在实验后期, 对这5株产毒的群体微囊藻胞内毒素含量进行检测, 结果表明, 随着光强的增强, 群体微囊藻单位生物量的胞内毒素含量明显增加(图 5)。当黑暗和光强为 10—25 μmol/(m2·s)时, 5株产毒群体微囊藻单位细胞的胞内毒素含量保持在较低水平, 毒素含量增加不明显(P>0.05)。而当光强为 80—200 μmol/(m2·s)时, 微囊藻单位细胞毒素含量显著上升(P<0.05), 其中当光强为 200 μmol/(m2·s)时, DH- M1、DC-M2、TH-M2、FACHB1174和FACHB 1027单位细胞毒素含量与对照相比分别上升了 48.82%、30.55%、74.01%、61.51%、60.82%。

3 讨论

浮游植物可能产生不同的基因型或表型来应对外界环境的变化。改变自身形态形成群体或集聚是最常见的一种形式。O’Farrell, et al.[26]的研究证实, 在野外水体中, 光限制的水层, 单细胞、无鞭毛及小群体浮游生物较多, 而有鞭毛和大群体的浮游生物常聚集在光照充足的水层。Naselli-Flores & Barone[27]的报道也提出,在地中海水库的不同水层中, 浮游植物形态和大小与其在水柱所接受的光强有密切关系。这些野外调查研究表明, 光强对藻类的形态建成有重要的影响, 然而这种影响过程及机制仍然缺乏充分的实验证据。Walsby, et al.[28]曾提出当微囊藻在高光强下培养时, 细胞平均体积比在低光强下时增大了两倍, 但是有关其变化机理并未阐明。此外, 对于微囊藻不同种/株系之间其形态变化对光强的响应是否有差别也需要进一步的探析。本研究以6株不同种的群体微囊藻为实验材料, 对其在不同光强处理下的形态进行观察及群体大小进行测量, 结果表明, 在高光强条件培养下的微囊藻群体直径显著增大, 且不同种/株系的微囊藻其响应机理有明显的差异。

图3 第15天不同光强下群体微囊藻的胞外多糖(A)和胶被多糖(B)含量Fig. 3 Contents of soluble extracellular polysaccharide (A) and bound extracellular polysaccharide (B) of Microcystis cultured under different light intensities on the 15th day

图4 不同光强下群体微囊藻12h、24h内mcy转录水平Fig. 4 Transcript levels of mcy in Microcystis under different light intensities in the 12h and 24h, respectively

图5 第15天不同光强下群体微囊藻的胞内毒素含量Fig. 5 Intracellular microcystins content of Microcystis cultured under different light intensities on the 15th day

3.1 胞外多糖和生长对微囊藻群体大小的影响

胞外多糖是群体形成的物质基础, 群体微囊藻的细胞外包裹着多糖黏液层, 同时藻细胞的聚集需要一定量的胞外多糖才能维持[29]。与解聚成单细胞的微囊藻相比, 群体微囊藻的溶解性胞外多糖、胶被多糖及总糖含量更高[30]。许多研究表明, 胁迫条件可以引起微囊藻光合产物 EPS (Extracellular polysaccharides)和酸性多糖的产生和释放, 如浮游动物的捕食、高浓度的钙、毒素等[9,11,13], 从而导致了微囊藻群体的形成。而Zhang & Kojima[31]在对布朗葡萄藻(Botryococcus braunii)的研究中也发现, 随着光强的减弱, 藻细胞分泌的胞外多糖含量下降,群体尺寸变小。本研究表明, 与对照组相比, 群体微囊藻TH-M2、DC-M1、FACHB1174和FACHB1027在高光强下单位生物量的胞外多糖及胶被多糖含量都显著升高, 这为诱发藻细胞之间的黏合聚积成大群体提供了可能。而另2株微囊藻DH-M1和DC-M2在高光强下的胞外及胶被多糖含量虽然有所提高,但增加的并不显著。Egan & Trainor[32]发现藻密度也能影响藻类的形态, 低的藻密度有利于单细胞栅藻(Scenedesmus)的产生, 而高浓度有利于群体的形成。对这6株群体微囊藻的生长速率的测定结果发现, DH-M1和DC-M2即使在高光强下, 生长速率仍然很高, 当光强为 200 μmol/(m2·s)时, 藻细胞密度最大。而另4株微囊藻在80—200 μmol/(m2·s)光强范围内, 生长速率无明显差异。此外,在前期实验中也发现, DH-M1和 DC-M2比另4株微囊藻具有更高的光饱和点, 且在高光强下具有更强的光合活性[8], 这说明DH-M1和DC-M2更耐受高的光强, 另4株微囊藻在高光强下生长受到胁迫。

Potts[33]认为, 藻类分泌大量的EPS并不是浪费, 而是一种生理策略上的进化,使其具有更强的适应性, 能更好的生长和生存, 尤其是在不利的环境条件下, 这种策略更显优势。由此可推测, TH-M2、DC-M1、FACHB1174和FACHB1027这4株微囊藻在高光强下通过分泌大量的 EPS, 使群体尺寸变大, 以形成更大的群体适应高光强的环境,而 DH-M1和 DC-M2由于在高光强下藻密度最大,是通过生长来促进群体尺寸的增加。后续的研究结果也证实了, TH-M2、DC-M1、FACHB1174和FACHB1027这4株微囊藻增大群体尺寸, 细胞聚集紧密且分泌较多的 EPS, 是为了快速下沉躲避高光强的伤害; DH-M1和DC-M2增大群体尺寸, 加快生长使其结构较松散以减小细胞密度快速上浮至液面表层[8]。

3.2 微囊藻毒素对微囊藻群体大小的影响

此外, 已有的研究指出, 高浓度的MCs能促进微囊藻细胞的聚集[12]。而微囊藻的产毒是通过 mcy基因簇来调控的。Schatz, et al.[34]研究发现, 无论是程序性死亡还是受到各种胁迫所引起的微囊藻细胞裂解, 其后释放的MCs能诱导其余的微囊藻McyB蛋白的大量积累, 从而促进这部分微囊藻MCs的产生。Kaebernick, et al.[23]以不同光强和光质处理微囊藻, 用RNase保护试验检测mcyB和mcyD的转录水平, 发现强光使mcyB和mcyD的转录水平升高, 这与本研究的结果是一致的, 高光强可通过 mcy基因簇的调控对MCs的产生有显著影响, 说明光照的影响可从基因转录的水平得到实现。

光对于MCs合成十分重要。Utkilen & Gjølme[35]研究发现, 在M. aeruginosa的连续培养体系中, 光强与毒素产生具有显著相关性, 光强升高时毒素含量增加, 而高于一定光强时毒素形成能力下降。Wiedner, et al.[36]也认为, 微囊藻PCC7806的毒素含量与光照强度成正相关关系。通过HPLC方法测定不同光强下微囊藻胞内毒素含量的结果发现, 除M.wesenbergii DC-M1不产毒外, 其余5株微囊藻在高光强下胞内毒素含量即有显著增加, 高浓度的微囊藻毒素为藻细胞的聚集提供了条件。在随后的研究中发现, 环境浓度的微囊藻毒素, 可通过激活部分与多糖合成相关的诱导因子而激发群体的聚集, 从而在微囊藻群体形态维持中起到重要作用[11]。这一结果也可以说明, 在本研究中高光强促进微囊藻胞内毒素的增加也是微囊藻群体变大的因素之一。

综上所述, 高光强能够促进微囊藻群体尺寸变大。但不同的微囊藻种, 其变化的生理学机制不同:光饱和点低的群体微囊藻, 通过分泌大量的EPS使群体尺寸变大以保护其自身免受高光强的伤害; 光饱和点高的群体微囊藻, 以加快生长的方式, 增加群体尺寸以减小细胞密度上浮促进光合吸收。同时,微囊藻胞内毒素的增加, 在微囊藻群体尺寸变大的过程中也起到重要作用。