龟鹿二仙胶对铅鼠海马CA1区长时程增强损伤的修复作用
2014-11-04吴传云阮迪云董昌武吴云龙周雪梅王建青
吴传云,阮迪云,董昌武,吴云龙,周雪梅,王建青
(1.安徽中医药大学中医临床学院,安徽 合肥 230038;2.中国科技大学生命科学院,安徽 合肥 230027)
WHO Prues博士的调查表明,全球有近半数5岁以下儿童的血铅水平超过10 μg/dL,其形势在发展中国家尤为严峻[1]。铅中毒在我国的流行率高达30% ~50%,而且有显著的地域差异[2-3]。
产前和早期铅暴露影响新生儿的体重身高及胎儿的生长发育[4-5]。铅改变了多巴胺能、胆碱能和谷氨酸能的神经递质的释放及其信号转导[6],只要血铅水平达到10 μg/dL,就可能会导致肾小管损伤、神经生理和认知缺陷、听觉系统和儿童生长发育障碍[7-8]。但更多的研究证明,即使儿童血铅水平低于10 μg/dL,也会有认知、视觉、运动及听觉系统的功能减退[9-10]。儿童的血铅水平与智商(IQ)显著相关,血铅水平每上升30~40 μg/dL,IQ值就会降低4~6分,并伴有认知功能和心理行为的改变。发育早期严重铅中毒会引起脑功能的不可逆损伤。
本研究通过具有滋阴填精、益气壮阳作用的龟鹿二仙胶对出生后铅暴露大鼠血铅、海马铅、CA1区突触可塑性的影响,探讨龟鹿二仙胶修复铅致学习记忆功能损伤的机制,为儿童铅中毒的中医药防治提供依据。
1 材料与方法
1.1 实验动物 本实验所用SD大鼠由安徽医科大学实验动物中心提供,合格证号:scxk(皖)2011-002,尽所有的努力,减少所用动物的数量及其痛苦。严格控制环境温度 (24±1)℃及相对湿度 (50±10)%,保持通风,并维持每天都有12∶12的白昼黑夜节律。
本实验采用本实验室以前用过的铅暴露模型[11],分娩当天将仔鼠随机分为4个实验组:(1)正常组;(2)正常+龟鹿二仙胶组;(3)铅组;(4)铅+龟鹿二仙胶组。铅组、铅+龟鹿二仙胶组母鼠在哺乳期间,仔鼠从第21天断奶到第60天,一直饮用含有0.2%(1090 mg/kg)的醋酸铅的饮用水,而其它对照组大鼠一直饮用去离子水。出生后第60天,测定血铅水平,判断铅中毒程度。用中药 (龟鹿二仙胶,1.17 g/kg)给正常+龟鹿二仙胶组及铅+龟鹿二仙胶组的仔鼠灌胃2周,同时给正常组的仔鼠以0.9%生理盐水灌胃。随后进行电生理记录实验。实验确保每组动物雌雄数目相同。
1.2 血液和海马铅水平测定 电生理实验结束后心脏取血2 mL,所有的样品均保留一式两份。采用石墨炉原子吸收光谱法测血铅。在整个测定过程中一直要严格控制外源性铅污染。按步骤严格进行铅标准品、质控及样品吸光度值测定,最后根据标准曲线推算出血铅水平。快速剥取实验大鼠的海马立即冷藏,以备测海马铅水平用。采用液态等离子质谱仪 (VG Elemental,UK)分析硝解后的海马样本,测定铅水平。
样品处理过程:在洗净并蒸干的玻璃小烧杯中称量样品,加入2 mL的MOS级浓HNO3,低温加盖加热样品溶液至近干,补加HNO31 mL及5滴MOS级浓HClO4,继续加盖加热至烧杯内白烟冒尽,期间不断摇晃烧杯,使烧杯内溶液分布均匀,以免局部过度受热结碳,冷却,加上述HNO34滴及少量水,充分振荡摇匀,定容为 5.00 mL,待测。
1.3 海马CA1区长时程增强 (LTP)的在位电生理记录 海马场电位记录按文献报道的方法进行[12-14]。采用腹腔注射1.8 g/kg 10%乌拉坦麻醉大鼠,在实验需要时可补充至外科水平。将其头部固定在立体定位仪 (江湾1型)上,暴露头骨。监测直肠温度,用自动加热垫维持在 (37±0.5)℃。用双极钨丝电极作刺激电极,定位于CA1区海马薛氏侧枝/联合纤维(前囟后4.2 mm,中缝右旁3.8 mm,深度约2.8 mm),记录电极定位于海马CA1区的近端树突层 (前囟后3.4 mm,中缝右旁2.5 mm,深度约2.0 mm)。该套管包括两个相互隔离的钨丝电极 (特氟龙酯覆盖厚度为230 μm)和一个引导管 (尺寸为26号)。两钨丝电极黏附在不锈钢的引导管两侧,从引导管末端伸出800 μm。将引导管的内管 (尺寸为31号)插入到海马CA1区记录位点上方约300 μm处。将内管通过聚乙烯管连接微量注射器 (Hamiltonsyringe,10 μL)。来源于CA1区的电信号被放大1000倍,滤波带宽为1~3 kHz,在10 kHz数值化。记LTP时,刺激强度调整为最大场兴奋性突触后电位(field excitatory postsynaptic potential,fEPSP)的40%~50%时的强度。强直刺激前记录20 min基线 (变化幅度<10%)。强直刺激的参数设定为:主间隔1 s,即每隔1 s给一串刺激,每串包括200 Hz,20个pulse,共给5个串,隔1 min重复6次。在强直刺激后恢复之前的单脉冲刺激并记录1 h以上。
1.4 试验药物 龟鹿二仙胶由澳门同福堂黄家济志药行生产,生产批号HKP-05148。所用试剂质量均为最高等级,所有溶液均在实验前临时配制。
1.5 数据统计和分析 把以fEPSP的起始斜率作为参数来衡量实验反应的大小,将20 min的基线反应作为平均的基值 (100%),高频刺激后60 min的fEPSP幅度叠加的平均值除以高频刺激前基线反应的平均基值的结果是LTP的幅度。实验所取得的电生理数据均用 Igor 4.0(Wave Metrics,OR,USA)分析获得,然后用Origin 8.0(OriginLab,MA,USA)进行统计处理。所有数据结果均采用均数 (Mean)±平均标准误差 (Standaxd Error Mean,SEM)表示,统计结果用One-way ANOVA分析,Bonferroni test矫正,以P<0.05为有显著性差异。
2 实验结果
2.1 龟鹿二仙胶不能降低染铅大鼠的血铅水平实验各组大鼠全血血铅水平测定结果见表1。可以看出,染铅组大鼠血铅水平比正常对照组明显升高,有显著性差异 (P<0.01);而同期龟鹿二仙胶治疗组血铅水平比染铅组没有明显降低,表明龟鹿二仙胶没有降血铅作用。提示龟鹿二仙胶对于铅中毒的修复作用可能不是通过降血铅来完成的。
表1 龟鹿二仙胶对铅鼠血铅水平的影响Tab.1 Effects of Guilu Erxian Gel on blood lead level in lead-exposed rats
2.2 龟鹿二仙胶部分降低染铅大鼠的海马铅水平 实验各组海马铅水平详细列在表2中,染铅组的海马铅水平明显高于正常对照组 (P<0.01),表明本实验铅暴露模型的成功,用龟鹿二仙胶治疗2周后海马铅水平与铅组有显著差异 (P<0.01),但仍高于正常组 (P<0.01)。这些检测结果表明,慢性铅暴露增加了大鼠海马铅水平,而龟鹿二仙胶的干预可以部分减少由此引起的海马铅水平的上升。
表2 龟鹿二仙胶对铅鼠海马铅水平的影响Tab.2 Effects of Guilu Erxian Gel on hippocampal lead level in lead-exposed rats
2.3 龟鹿二仙胶对染铅大鼠海马CA1区LTP损伤有部分修复作用 图1显示的是龟鹿二仙胶对正常组、铅组、正常+龟鹿二仙胶组、铅+龟鹿二仙胶组大鼠LTP的诱导和维持的影响。正常组(195.8%±10.8%,n=8)与正常+龟鹿二仙胶组 (199.7%±14.3%,n=8)LTP幅度无显著差异 (P>0.05)。提示龟鹿二仙胶对正常对照组海马CA1区LTP的幅度没有影响。实验发现铅组大鼠LTP的幅度显著下降到 (145.7% ±11.7%,n=7)(P<0.01),虽然铅鼠经过龟鹿二仙胶治疗后的LTP幅度 (175.6%±10.8%,n=7)明显高于铅组 (P<0.05),但仍低于正常组的LTP幅度(P<0.05)。这些结果表明,在大鼠发育期铅暴露时,龟鹿二仙胶能够在一定程度上保护但不能完全逆转铅诱导的海马CA1区LTP的损伤,龟鹿二仙胶部分修复了慢性铅暴露组LTP幅度的损伤。
图1 龟鹿二仙胶对铅鼠海马CA1区LTP损伤的影响Fig.1 Effects of Guilu Erxian Gel on lead-induced LTP impairment in the CA1area
3 讨论
神经系统是铅中毒的主要攻击目标。科学家们推测,正是由于胎儿大脑的血脑屏障未发育完全并且缺乏能结合铅的某些保护性组织蛋白,才使得它特别易于受到铅毒性的影响[15]。本研究旨在验证铅中毒导致的智力损伤可以用龟鹿二仙胶加以预防这一假设。本实验结果也证明了龟鹿二仙胶对铅暴露组大鼠海马SC-CA通路LTP损伤有一定的修复作用。
中医认为铅味甘,性寒,有小毒。铅性寒,为阴邪,易伤阳气,导致脾肾阳虚证,终则阴阳两虚。未成年人铅中毒当属肾精不足证,多因先天禀赋不足 (由母体染毒),或后天失养 (后天染毒),小儿肾精不充,不能主骨生髓充脑,不能化生气血,生长肌肉,则发育迟缓,身材矮小,囟门迟闭,智力低下,骨骼萎软,动作缓慢,腰酸,健忘。本研究以此为理论依据,治疗时选择具有滋阴填精益气壮阳作用的龟鹿二仙胶。方剂由鹿角、龟甲、枸杞子、人参组成,龟鹿皆灵而有寿,可补肾、补血、补精、补气,再加上人参、枸杞,益气生精,诸药相配,能补阴益阳,延年益寿,生精补肾。
海马是铅的最重要的靶组织,也是学习记忆所必需的脑结构。迄今为止,公认的学习记忆的基础是突触可塑性,长时程增强 (LTP)是最经典的突触可塑性的细胞模型[16]。海马牵涉到外显记忆,并在记忆的编码和形成中起关键作用[17]。海马包括三个分区:CA1区,CA3区和 DG区,确切的说,CA1区是海马空间记忆的重要区域,学习记忆以突触可塑性的形式在这里在编码,巩固和储存[18-19]。突触可塑性依赖于不同突触前、后神经元机制及其周围的胶质细胞,记忆的产生涉及突触可塑性的持续性变化,突触前后的许多成分参与了LTP的产生。许多研究表明铅损伤了发育期大鼠海马的CA1区和齿状回的LTP的诱导,幅度和维持时间[20-22]。在本实验中也取得了类似的结果,铅组大鼠LTP的幅度明显下降。
龟鹿二胶中含有丰富的微量元素锌,有研究表明,补锌可拮抗慢性铅暴露导致的血及海马中铅含量的升高,增加海马中BDNF mRNA的表达,并可减轻铅对小鼠学习记忆的损伤[23-24]。本研究中,发育期铅暴露组与正常对照组相比,血铅水平显著增加。这些血铅水平类似于本课题组以前的实验结果[22]。同时也发现龟鹿二仙胶可以部分降低海马铅水平,虽然没能降低血铅水平,但这可能和铅的代谢特点有关。本实验结果还证实了龟鹿二仙胶可以部分修复铅导致的LTP的幅度降低,提示龟鹿二仙胶可能对慢性铅暴露引起的智力损伤有正面影响。以上实验证明,龟鹿二仙胶能保护发育期大鼠的突触可塑性免受出生后铅暴露引起的损伤。关于龟鹿二仙胶对铅致智力损伤的修复机理还需要进一步进行更深层次的研究。龟鹿二仙胶与不同程度铅中毒及不同发育期的铅中毒之间的关系还需要进一步的实验加以论证。
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