HPLC-ELSD法测定金线莲提取物中金线莲苷

万 婷，熊富良

(武汉理工大学化学工程学院，湖北武汉 430070)

金线莲Anoectochilus roxburghi，即花叶开唇兰，又名金蚕、金线兰等，是兰科开唇兰属的一种多年生的草本植物［1］。它主要分布于亚洲的日本、中国、印度和尼泊尔等国，我国的福建、贵州、台湾等省也都有比较丰富的金线莲资源［2］。金线莲是我国传统的珍贵药材，有清热解毒、滋补养阴降火、消炎减轻疼痛等功效［3］。在现代中药研究中，金线莲多用于糖尿病、高脂血、乙型肝炎等疾病的治疗［4］。随着对金线莲研究的不断加深，金线莲的优良治疗效果日益得到瞩目，受到广大民众的青睐，具有广阔的开发前景。

金线莲苷 (kinsenoside)是金线莲的特质性成分，为葡萄糖与五元内酯环的手性碳以氧苷键形式连接形成的苷［5］，据文献报道该属植物含金线莲苷的水提物有保护肝脏、降血脂、降低血糖、止痛、消炎等广泛的药理活性［6-7］。因此本研究主要是对金线莲中的金线莲苷类成分进行提取纯化，并对金线莲苷进行定量分析研究，建立HPLC-ELSD测定方法。有少量文献发表金线莲苷的定量测定方法［8］，但是其检测方法分离度不高，准确性不是很好。

1 实验材料

美国戴安公司DIONEX P680高效液相色谱仪(P680型输液泵、真空脱气机、自动进样器、柱温箱、Chromeleon色谱工作站);SEDEX 75型蒸发光散射检测器 (法国迪马公司);Hypersil NH2色谱柱 (5 μm，4.6 mm ×250 mm);AB204-N型万分之一电子分析天平 (美国METTLER TOLEDO公司);LC-350A型超声波中药处理机 (山东济宁鲁超超声设备有限公司)［9］。

金线莲药材 (华中科技大学同济医学院药学院提供，经中国科学院武汉植物研究所王映明教授鉴定)。金线莲苷对照品为自制，纯度经 TLC、HPLC、质谱、熔点和旋光度测定等进行纯度鉴定，纯度在98%以上，符合“中药新药质量标准用对照品研究的技术要求”［10］;金线莲提取物样品(自制，批号分别为20130401、20130502、20130503);乙腈为色谱纯 (美国Tedia公司);水为超纯水;其余试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 金线莲提取物样品制备 取干燥的金线莲药材，剪碎，加20倍量95%乙醇回流提取3次，每次2 h。将3次提取液合并，浓缩至无醇味，加入20倍水，搅匀，静置过夜，离心，过滤，得上清液。将上清液浓缩至比重为1.3左右，上DM131大孔吸附树脂，用水洗脱，收集流出液，减压浓缩，真空干燥即得金线莲提取物。

2.2 色谱条件与系统适用性试验 Hypersil NH2色谱柱 (5 μm，4.6 mm×250 mm);流动相为乙腈-水 (92 ∶8)［11］;体积流量为1.0 mL/min;柱温30℃;蒸发光散射检测器雾化室温度为40℃;载气为高纯氮气，氮气压力为350 kPa［12］;信号值为7。理论塔板数按金线莲苷峰计算不低于10000，系统适用性良好。

2.3 溶液制备

2.3.1 对照品溶液的制备 精密称取金线莲苷对照品适量，加甲醇制得每1 mL含0.5 mg的金线莲苷，摇匀，即得。

2.3.2 供试品溶液的制备 取本品，研细，精密称取约0.2 g，置100 mL具塞锥形瓶中，精密加入50 mL水，密塞，超声处理30 min，摇匀，滤过，取续滤液。精密量取1 mL续滤液，置于10 mL量瓶中，加乙醇至刻度，摇匀，即得。

2.3.3 空白溶剂样品溶液的制备 精密量取1 mL水，置于10 mL量瓶中，加乙醇至刻度，摇匀，即得。

2.4 专属性试验 分别精密吸取对照品溶液、供试品溶液和空白溶剂样品溶液各10 μL，注入液相色谱仪，记录色谱图。结果显示，本方法专属性较好，溶剂无干扰，见图1。

2.5 线性关系考察 精密量取对照品溶液 (金线莲苷 0.524 mg/mL)1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、10 mL，置于10 mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，精密吸取上述溶液各10 μL，注入液相色谱仪，测定峰面积，以峰面积积分值 (mAu×min)的对数值为纵坐标 (Y)，对照品的进样量 (μg)的对数值为横坐标 (X)进行线性回归，得金线莲苷回归方程为Y=0.7527X－1.2561(r=0.99993)，线性范围为 0.524 ～5.24 μg。

2.6 检测限和定量限考察 量取对照品溶液，逐步稀释成一系列浓度由高到低的对照品溶液，按“2.2”项色谱条件进样，测得检测限 (S/N=3)和定量限 (S/N=10)分别为0.1514、0.5073 μg。

图1 高效液相色谱图Fig.1 HPLC chromatograms of kinsenoside reference substances，sample and negative sample

2.7 精密度试验 精密吸取上述供试品溶液，按“2.2”项色谱条件连续重复进样6次，测定峰面积。结果金线莲苷RSD为1.56%，表明仪器精密度良好。

2.8 稳定性试验 取供试品溶液，按“2.2”项色谱条件，分别于0、1、2、3、4、6 h进样，测定峰面积。结果金线莲苷峰面积的RSD为1.87%，表明供试品溶液在6 h内稳定性良好。当供试品溶液超过6 h进样后，峰面积的RSD值超过2%，达不到稳定性试验的要求。

2.9 重复性试验 取同一批号样品 (批号20130401)0.2 g，平行称取6份，按“2.3.2”项下处理，按“2.2”项色谱条件测定，计算。结果金线莲苷含有量为48.03%，RSD为1.64%，表明该方法重复性良好。

2.10 加样回收试验 取已知含有量的样品 (批号20130401)0.1 g，平行称取6份，精密称定，置50 mL量瓶中，精密加入对照品溶液10 mL(金线莲苷4.84 mg/mL，溶剂为水)，加水至刻度，密塞，超声处理30 min，摇匀，滤过，取续滤液。精密量取续滤液1 mL，置于10 mL量瓶中，加乙醇至刻度，摇匀，即得。按“2.2”项色谱条件，测定，计算回收率，结果见表1。

表1 加样回收试验结果 (n=6)Tab.1 Results of recovery tests(n=6)

2.11 样品测定 取3批样品，按上述“2.2”项色谱条件及方法测定，计算，结果见表2。

表2 样品测定结果 (n=5)Tab.2 Results of determination(n=5)

3 讨论

3.1 测定方法的选择 关于金线莲苷的成分定量测定的文献比较少，且都是采用的高效液相色谱与紫外检测器联用［8，13］，作者也尝试按照文献的方法来测定金线莲苷的量，实验中发现金线莲苷的紫外吸收度非常小，而杂质的吸收很强，因此用紫外检测将无法正确测定金线莲苷的量。且采用C18柱时，金线莲苷极性较大，出峰时间过早，干扰较大，要达到分离度1.5的完全分离较困难，不适合作为药品的定量测定方法。后期研究发现采用HPLCELSD法，并且使用氨基柱，能够针对性地检测金线莲苷的量，金线莲苷出峰时间比较适当，分离度比较好，基本不存在干扰，检测方法灵敏度较高。

3.2 样品提取纯化方式的选择 根据金线莲苷结构得知，金线莲苷是一个五元环内酯与葡萄糖连接形成的苷类。所以金线莲苷极性偏大，易溶于水、乙醇和甲醇，但是由于金线莲苷的内酯环结构和苷类结构的影响，金线莲苷在酸碱性溶剂环境下不稳定，易开环分解。所以在前期对金线莲药材采取两种提取纯化方式，一种是水提醇沉，一种是醇提水沉。结果发现，醇提水沉效果要好于水提醇沉，可能跟金线莲苷在水环境下易分解有关系。

3.3 测定时，由于金线莲苷的不稳定性，所以供试品溶液在超过6 h后进针，峰面积的RSD超过2%。因此供试品溶液需要在配制的6 h内进针，才能准确地进行结果计算。另外，对流动相的组成和比例进行了研究，发现当提高乙腈在流动相中的比例时，金线莲苷的出峰时间推后，能够跟溶剂峰分离开来，但是当乙腈比例达到95%时，金线莲苷不出峰，因此要选择合适的流动相组成和比例。

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［3］唐 菲，张小琼，徐江涛，等.金线莲降血糖活性部位的筛选［J］.中草药，2011，42(2):340-342.

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