党参ISSR-PCR反应体系的建立与优化△

张延红，高素芳

(甘肃中医学院 药学系，甘肃 兰州 730000)

党参ISSR-PCR反应体系的建立与优化△

张延红*，高素芳

(甘肃中医学院 药学系，甘肃 兰州 730000)

目的建立党参的ISSR-PCR反应体系，为今后利用ISSR标记技术进行党参鉴定及种质遗传多样性分析提供一个标准化程序。方法采用试剂盒法提取党参基因组DNA为模板，通过单因素实验分析了ISSR-PCR反应体系中MgCl2、dNTPs、引物浓度、TaqDNA聚合酶、模板DNA用量及退火温度对ISSR-PCR扩增的影响。结果建立了重复性好，分辨率高的ISSR-PCR反应体系，即在25μL反应体系中，含有10×PCR Buffer缓冲液2.5 μL，MgCl22.0 mmol·L-1，dNTPs 0.5 mmol·L-1，引物0.4 μmol·L-1，Taq DNA聚合酶1.0 U，模板DNA为30 ng；扩增程序为：94 ℃预变性5 min，然后94 ℃变性30 s，51.7 ℃退火1 min，72 ℃延伸1.5 min，共计35个循环，循环结束后在72 ℃延伸7 min，4 ℃保存。结论建立了适用于党参的ISSR-PCR反应体系，为应用ISSR技术鉴定党参种质资源、分子标记辅助选择育种及其遗传多样性研究奠定了基础。

党参；ISSR-PCR；反应体系；优化

党参为桔梗科植物党参CodonopsisPilosula(Franch.)Nannnf.的干燥根，为我国大宗、常用药材，也是甘肃道地药材之一，是中国常用的传统补益用药，具有补中益气、健脾益肺之功效，广泛用于脾肺虚弱、气短心悸、食少便溏、虚弱咳嗽等症[1]。近年来野生党参资源已十分稀少，个体间的距离也较远[2]，因此，建立党参ISSR-PCR反应体系，进一步研究该物种的遗传多样性是一项十分必要的工作。

ISSR分子标记因具有操作简单、快速高效、遗传多态性高、重复性好等特点，近年来已广泛应用于植物品种鉴定，种质资源和遗传多样性的研究等方面。ISSR-PCR体系的专属性比较强，不同种植物，其反应体系有一定的差异，只有在最佳的条件下，才能获得稳定清晰的多态性条带[3-4]。本试验探讨了影响ISSR-PCR反应的多个因素，建立了党参ISSR-PCR反应体系，为进行党参种群间遗传分化的研究奠定基础。

1 材料与仪器

1.1 材料

试验所用党参种苗于2011年10月采自甘肃定西渭源县，以休眠芽为外植体进行组织培养，以试管苗的幼嫩茎叶作试材。

1.2 试剂

新型植物基因组DNA快速提取试剂盒(北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司)，10×PCR Buffer、Mg2+、dNTPs、TaqDNA聚合酶(科昊生物工程有限责任公司)，ISSR引物(南京金斯瑞生物科技有限公司)。

1.3 仪器

DYY-7型转移电泳仪，DYCP-32型电泳槽，GelDox XR凝胶成像仪，Biometra-Tgradient PCR梯度扩增仪。

2 方法

2.1 基因组DNA的提取及检测

用试剂盒法并略做修改提取DNA：(1)在1.5 μL离心管中加入450 μL溶液A，然后加入β-巯基乙醇2.26 μL；(2)取样品70 mg，在研钵中加入液氮充分研磨成粉末状；(3)将研磨好的粉末加到以上预备好的溶液A中，65 ℃水浴25 min，期间颠倒混匀样品5次，(4)除RNA：水浴完后，加入10 μL RNase混匀，25 ℃下静置10 min；(5)加入400 μL溶液B，充分混匀，常温静置5 min；12 000 rpm离心5 min；(6)除蛋白：加入500 μL氯仿，12 000 rpm离心5 min；(7)小心将上清转到一个新的离心管中(勿将沉淀吸入)，加入600 μL异丙醇，充分混匀，室温放置10 min；(8)12 000 rpm离心10 min，小心去上清(勿将DNA样品的沉淀倒出)；(9)加入600 μL溶液C，颠倒混匀俩次，12 000 rpm离心5 min，弃废液；(10)重复步骤(9)一次；(11)于室温敞盖放置，至无明显乙醇味；(12)加入130 μL溶液D，离心管中即为基因组DNA溶液。在0.7%(M/V)琼脂糖凝胶中电泳后成像，检测提取的DNA质量，将质量好的于-20 ℃保存以备用。

2.2 ISSR-PCR反应的初始条件及程序

党参ISSR-PCR体系的建立参考其它几种药用植物的ISSR-PCR反应体系[5-7]，确定初步的反应体系为：总体积25 μL，内含2.5 μL 10xPCR buffer，MgCl22.0 mmol·L-1，dNTPS 0.5 mmol·L-1，Primers 0.5 μmol·L-1，Taq DNA聚合酶0.5 U，模板DNA为30 ng。扩增程序为94 ℃预变性5 min，然后进行35个循环：94 ℃变性30 s，53.7 ℃退火1 min，72 ℃延伸1.5 min，循环结束后72 ℃延伸7 min，4 ℃保存。

2.3 退火温度的确定

利用梯度PCR模式，设定退火温度最低48.0 ℃，和最高58.0 ℃，扩增仪自动生成10个温度梯度：48.5、48.7、49.4、50.5、51.7、52.9、54.1、55.3、56.4、57.5 ℃；其余PCR扩增程序同2.2项下，以确定最佳退火温度。

2.4 ISSR-PCR反应体系的优化

党参ISSR-PCR反应体系的优化采用单因素试验，逐步确定体系中每个因素的最佳反应参数。MgCl2设以下5个浓度：1.5、2.0、2.5、3.0、3.5 mmol·L-1；dNTPs设以下5个浓度：0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mmol·L-1；引物(845)浓度设以下5个浓度：0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 μmol·L-1；Taq DNA聚合酶设以下5个浓度0.5、1.0、1.5、2.0、2.5U；DNA模板的用量设以下5个：30、35、40、45、50 ng。

2.5 ISSR-PCR扩增产物的鉴定

取扩增产物6 μL和上样缓冲液1 μL混匀后点样，在1.5%的琼脂糖凝胶上电泳分离，以0.5xTBE为缓冲液，稳压100V，电泳至凝胶的2/3处结束。采用EB染色法染色20 min，在凝胶成像系统上照相。

3 结果与分析

3.1 党参试管苗基因组DNA的提取

本试验提取的DNA为无色沉淀，如图1，各泳道点样孔比较干净，DNA条带无拖尾，表明该方法所提的DNA质量较好，可用于ISSR-PCR体系优化的模板。

M：DNA marker 1～4为提取的基因组DNA 图1 党参基因组DNA的电泳结果

3.2 退火温度对ISSR扩增的影响

退火温度明显影响ISSR-PCR反应的进行，不同引物的退火温度通常也不一样，以845为引物，进行退火温度梯度试验，由PCR梯度扩增仪自动生成10个温度，确定了引物845以党参基因组DNA为模板扩增的最佳退火温度。由图2可知，退火温度为48.5、48.7 ℃时，背景有点模糊；温度为49.4、50.5、51.7 ℃时，条带清晰，亮度适宜；温度为52.9 ℃时，条带减少；温度为54.1、55.3 ℃时，条带之间界限不太明显；温度为56.4、57.5 ℃时，条带减少，模糊不清。因此，退火温度过高或过低都不利于产物扩增，在允许的范围内，选择较高的退火温度可减少引物与模板之间的非特异性结合，提高反应的特异性，因此，引物845的最佳退火温度为51.7 ℃，以下试验均采用51.7 ℃的退火温度。然后在这一条件下，研究ISSR-PCR反应中其他因素对扩增效果的影响，从中选择确定最优的反应条件。

M：DNA marker 1～10温度为48.5、48.7、49.4、50.5、 51.7、52.9、54.1、55.3、56.4、57.5 ℃ 图2 退火温度对ISSR扩增的影响

3.3 MgCl2浓度对ISSR扩增的影响

MgCl2浓度对ISSR-PCR反应的特异性和扩增效率均有较大的影响，在反应体系中MgCl2浓度过低，会显著降低酶的活性，而MgCl2浓度过高时，又使酶催化非特异性扩增增强，试验设5个MgCl2浓度梯度进行筛选，如图3所示，MgCl2浓度为1.5 mmol·L-1时，扩增的条带较少；MgCl2浓度为2.0 mmol·L-1时，能得到清晰稳定的条带；MgCl2浓度为2.5～3.0 mmol·L-1时，扩增的产物只有个别几条带，而且模糊不清；MgCl2浓度为3.5 mmol·L-1时，条带较暗。因此，选择2.0 mmol·L-1MgCl2作为党参ISSR-PCR反应体系的最佳浓度。

M：DNA marker 1～5 MgCl2浓度分别为1.5、2.0、2.5、3.0、3.5 mmol·L-1图3 MgCl2浓度对ISSR扩增的影响

3.4 dNTPs浓度对ISSR扩增的影响

适宜的dNTPs对于获得理想的ISSR-PCR扩增产物尤为重要，如图4所示，当dNTPs浓度为0.1～0.2 mmol·L-1时，扩增条带少且较弱；在0.3～0.5 mmol·L-1时，条带多而清晰，多态性好，相对而言0.5 mmol·L-1更清晰些；所以本试验选择0.5 mmol·L-1的dNTPs浓度作为党参ISSR反应体系的最佳浓度。

3.5 引物浓度对ISSR扩增的影响

引物浓度对PCR扩增的带型有明显的影响，浓度过低会导致ISSR-PCR产物量降低；而引物量过高，则会引起碱基错配和非特异性的扩增，生成引物二聚体，从而使目的DNA片段的扩增量下降。如图5所示，当引物浓度为0.1 μmol·L-1时的扩增条带最少；当引物浓度为0.2～0.3 μmol·L-1时，扩增条带较少，而且条带不清晰；浓度为0.4～0.5 μmol·L-1时，条带多而清晰，相对而言以0.4 μmol·L-1的条带最清晰明亮；因此，选择0.4 μmol·L-1的引物浓度作为党参ISSR-PCR反应体系的最佳浓度。

M：DNA marker 1～5 dNTPs浓度分别为0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mmol·L-1图4 dNTPs浓度对ISSR扩增的影响

M：DNA marker 1～5引物浓度分别为0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 μmmol·L-1图5 引物浓度对ISSR扩增的影响

3.6 Taq DNA聚合酶对ISSR扩增的影响

Taq DNA聚合酶在ISSR-PCR体系中的加入量也很重要，若量过少会影响靶序列扩增产量，而过多则会导致非特异性的扩增；如图6所示，Taq DNA聚合酶用量为0.5 U时扩增条带少而不清晰；Taq DNA聚合酶用量在1.0 U的条带背景较1.5～2.5 U的清晰，1U时的扩增条带明显，反应稳定；因此，选择1.0 U的Taq DNA聚合酶浓度作为党参ISSR-PCR反应体系的最佳浓度。

3.7 模板DNA的用量对ISSR扩增的影响

模板DNA用量对ISSR-PCR扩增产物的特异性和稳定性影响不大，如图7所示，本试验提取的DNA用量为30～50 ng的范围内，均可扩增出条带清晰的产物，因此30～50 ng的DNA模板均适合党参基因组DNA PCR反应的用量，相对而言，DNA用量30 ng时扩增条带较明显，因此本试验选择DNA用量为30 ng作为党参ISSR-PCR反应体系的最佳浓度。

M：DNA marker 1～5 Taq DNA聚合酶浓度分别为0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 U 图6 Taq DNA聚合酶对ISSR扩增的影响

M：DNA marker 1～5 模板DNA的用量分别为30、35、40、45、50 ng 图7 模板DNA的用量对ISSR扩增的影响

4 结论与讨论

4.1本试验以党参基因组DNA为材料，建立了分辨率高、可靠性好的党参ISSR-PCR反应体系，即在25 μL反应体系中，含有10×PCR Buffer缓冲液2.5 μL，MgCl22.0 mmol·L-1，dNTPs 0.5 mmol·L-1，引物0.4μ mol·L-1，Taq DNA聚合酶1.0 U，模板DNA为30 ng；通过梯度退火得到引物845的最佳退火温度为51.7 ℃；扩增程序为：94 ℃预变性5 min，然后94 ℃变性30 s，51.7 ℃退火1 min，72 ℃延伸1.5 min，共计35个循环，循环结束后在72 ℃延伸7 min，4 ℃保存。得到了清晰，多态性高的ISSR谱带，为ISSR-PCR在党参的分类鉴定和育种学研究中的应用奠定了基础。

4.2ISSR分子标记技术基于PCR反应，它具有以下优点：不需要事先知道靶序列；由于较高的退火温度和更长的引物序列，可产生重复性好的扩增带；模板需要量少，多态性丰富，结果记录方便。目前已广泛应用于植物品种鉴定，遗传图谱和遗传多样性等方面的研究。但影响ISSR扩增结果的因素较多，各因素的变化会不同程度地影响到带谱的准确性与稳定性[8]，因此，有必要对其影响因子进行筛选和优化，确立最适宜的ISSR反应体系。退火温度对扩增条带的清晰程度和条带数目有明显影响。引物的碱基构成不同，适宜的退火温度就可能不同，因此，只有针对不同的引物进行相应的退火温度设计、优化，才能获得清晰、稳定的扩增带。模板浓度在30～50 ng之间扩增结果相同，红松ISSR-PCR实验系统影响因素研究一文中发现模板浓度在10～200 ng之间扩增结果相同[9]，说明ISSR-PCR对模板浓度的要求范围较宽，具有较好的可重复性和稳定性。

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Establishment and Optimization of ISSR-PCR Reaction System for Codonopsis Pilosula(Franch.)Nannnf.

ZHANG Yanhong*，GAO Sufang

(DepartmentofPharmacy，GansuCollegeofTCM，Lanzhou730000，China)

Objective：The study focused on setting up ISSR-PCR reaction system ofCodonopsispilosula(Franch.)Nannnf.，which will provide a standard procedure for Codonopsis germplasm resources analysis.MethodsDNA ofC.pilosulawas extracted by kit method，and the influence of MgCl2，dNTPs，primer concentration，Taq DNA polymerase，DNA template amount and the annealing temperature on ISSR-PCR amplification were studied by single factor experiment.ResultsThe optimal reaction system for ISSR analysis contains 10×PCR Buffer 2.5 μL，2.0 mmol·L-1MgCl2，0.5 mmol·L-1dNTPs，0.4 μmol·L-1primer，1.0 U Taq DNA polymerase，30 ng template DNA，in 25 μL total reaction volume.Amplification procedure is：94 ℃ initial denaturation 5 min，and then 94 ℃ denaturation 30 s，51.7 ℃ annealing 1 min，72 ℃ extends 1.5 min，total of 35 cycles，after the cycles extension for 7 min at 72 ℃，storing at 4 ℃.ConclusionThe stable and reproducible optimal ISSR-PCR reaction system was established forC.pilosula，which laid a good foundation for germplasm resources identification，molecular marker assisted breeding and genetic diversity study.

Codonopsispilosula(Franch.)Nannnf.；ISSR-PCR；Reaction system；Optimization

“十二五”国家科技支撑计划课题(2011BAI05B02)

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张延红，副教授，研究方向：药用植物育种和组织培养，Tel：(0931)8765393，E-mail：zhyh456789@163.com

10.13313/j.issn.1673-4890.2014.07.008

2014-02-08)