高尔基体膜蛋白73在原发性肝癌患者血清中的表达及其早期诊断价值

陈海波， 顾玉明， 王 洵

原发性肝癌（PHC）早期诊断率低。寻找特异性更高、更灵敏的肿瘤标志物和实验室诊断方法是研究 PHC 的重要方向［1］。 GP73（Golgi protein-73），主要表达于人类多种组织的上皮细胞，肝细胞不表达或很少表达，而后大量研究表明：血清中GP73水平高低与PHC关系密切，在PHC检测的灵敏度和特异度上均远高于AFP，有望成为原发性肝癌早期诊断的肿瘤标志物［2-3］。

临床中，布加综合征 （BCS）合并肝细胞癌（HCC）并不少见［4-5］，二者合并发生的具体机制尚不清楚。

本研究以肝脏疾病、BCS合并HCC患者及健康志愿者为研究对象，应用电化学发光法和ELISA方法检测各组血清中AFP值和GP73的表达水平，分别计算诊断的曲线下面积、灵敏度、特异度及正确率，探讨GP73对原发性肝癌的早期诊断价值。

1 材料与方法

1.1 研究对象

收集2013年3月—2014年1月在徐州医学院附属医院就诊的患者及健康志愿者490例。其中：① HCC 65例，男55例、女10例，年龄41～78岁，平均52岁。通过穿刺活检、手术后病理学、DSA、B型超声、CT中的1种或多种手段证实［6］。② 胆管细胞肝癌35例，男25例，女10例，年龄40～75岁，平均53岁。符合参考文献［7］的诊断标准。③ BCS合并HCC 40例，男36例，女4例，年龄35～58岁，平均43岁。根据临床表现、肝功能、肿瘤标志物、超声、肝静脉及下腔静脉MRV、DSA造影及肝脏穿刺活检等综合确诊。④乙型病毒性肝炎（乙肝）60例，男40例、女20例，年龄20～69岁，平均39岁。符合乙肝诊断标准（2010年版）［8］。 ⑤ 乙肝肝硬化60例，男39例、女21例，年龄20～70岁，平均51岁。在排除肝占位性病变后，根据临床表现、肝功能指标检测和B型超声检查等确诊。⑥BCS合并肝硬化60例，男45例、女15例。年龄20～70岁，平均47岁。根据临床表现、肝功能、B型超声、肝静脉及下腔静脉MRV、DSA造影等综合确诊。⑦其他恶性肿瘤50例（胃癌20例、胰腺癌8例、食管癌10例、结肠癌2例、胆囊癌3例、直肠癌3例、十二指肠癌3例、肺癌1例），男 35例、女 15例，年龄 21～85岁，平均63岁。均获得活检或者手术病理学检测证实。⑧ 肝良性病变60例（肝血管瘤40例、肝囊肿10例、肝脓肿3例、脂肪肝3例、酒精性肝病4例），男25例、女35例，年龄24～87岁，平均62岁。均经B型超声、CT、DSA和穿刺活检中的一种或多种手段证实。⑨收集在我院进行体检的健康志愿者60例，男30例、女30例，年龄20～68岁，平均35岁。肝功能指标检测正常并B型超声检查排除实质性占位。

1.2 方法

1.2.1 标本采集方法 抽取待检者清晨空腹静脉血 3 ml，室温下自然凝集 30 min，36 000×g离心15 min，分离血清，将获得的血清-80℃冰箱中保存，血清标本的采集均获得受检者的知情同意。

1.2.2 检测方法

1.2.2.1 ELISA法检测血清GP73表达：取每例待检者血清10 μl加人96孔板中，严格按照试剂盒（德国IBL进口分装）说明书的要求操作，用酶联免疫检测仪检测各孔在450 nm波长处的吸光度（A）值，每个待测血清重复2个孔。同时试剂盒中的标准品以 5 个浓度（0、5、10、20、40﹑80 ng/ml）为标准点，以标准品5个浓度为横坐标，相应各点的A值为纵坐标绘制标准曲线，求得标准曲线公式及相关系数，后根据公式通过A值计算每例待检者血清样品的GP73表达水平。

1.2.2.2 血清AFP测定：采用电化学发光按照全自动Cobas601分析仪（瑞士Roche公司）的操作步骤检测每例待检者血清AFP水平，血清AFP水平的临界参考值为20 ng/ml，待检者血清AFP水平超出临界值时，即判定为阳性。

1.3 统计学方法

应用SPSS16.0统计软件对数据进行统计分析。由于各组样本方差不齐，GP73和AFP水平以中位数表示，组间比较采用非参数秩和检验。应用SPSS16.0软件描绘受试者工作特征（ROC）曲线，分析GP73和AFP检测效能并确定其临界值，根据临界值计算GP73和AFP诊断的阳性率，以HCC患者出现AFP＞20 ng/ml或GP73＞43.40 ng/ml为真阳性，胆管细胞癌患者出现GP73＞45.40 ng/ml为真阳性，良性肝病患者阳性为假阳性；以HCC患者AFP≤20 ng/ml或GP73≤43.40 ng/ml为假阴性，胆管细胞癌患者GP73≤45.40 ng/ml为假阴性，良性肝病阴性为真阴性，判断GP73、AFP单独诊断HCC、胆管细胞癌的灵敏度、特异度和准确率；各组中血清GP73和AFP值间的关系采用Spearman相关分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组待检血清GP73和AFP的表达水平

用于检测血清GP73浓度的标准曲线，线性关系良好。各实验组的GP73及AFP表达水平见表1，表2及图1。统计分析结果显示，HCC组、胆管细胞癌组及BCS合并HCC组患者血清GP73的表达水平显著高于其他组 （P＜0.05）；HCC组、BCS合并HCC组患者血清AFP的表达水平显著高于其他组（P＜0.05），胆管细胞癌组AFP的表达水平与健康体检组差别无统计学意义（P＞0.05）。

表1 各组血清GP73和AFP的表达水平

表2 各组血清GP73和AFP的表达水平

图1 各组GP73及AFP表达水平

2.2 血清GP73和AFP表达水平在HCC及胆管细胞癌中的诊断价值

分别绘制GP73和AFP的ROC曲线，当GP73取临界值为43.40 ng/ml时，诊断HCC的灵敏度、特异度及正确率达到最佳，分别为90.8%、75.5%及77.6%，ROC 曲线下面积（area under curve，AUC）为0.868；AFP取临界值为20 ng/ml时，诊断HCC的灵敏度、特异度及正确率分别为60%、83.2%及80.2%，AUC为0.739。GP73诊断HCC的灵敏度及AUC明显高于AFP，差异有统计学意义（P＜0.05），特异度及诊断正确率差异无统计学意义 （P＞0.05）。当GP73取临界值为45.40 ng/ml时，诊断HCC的灵敏度、特异度及正确率达到最佳，分别为88.6%、72.7%及73.9%，AUC为0.774。结果见表3、图 2、图 3。

表3 血清GP73和AFP的表达水平对诊断HCC、胆管细胞癌的灵敏度和特异度及正确率 ［%（n/n）］

图2 血清GP73及AFP诊断HCC的ROC曲线

2.3 各组待检者血清GP73和AFP表达水平之间的关系

图3 血清GP73诊断胆管细胞癌的ROC曲线

相关性分析结果显示，各组待检血清GP73和AFP表达水平之间均无相关性，HCC组r=0.018，P=0.887；胆管细胞癌组 r=-0.091，P=0.605；BCS合并HCC组r=0.061，P=0.708；乙型肝炎肝硬化组 r=-0.110，P=0.402；乙型肝炎组 r=-0.110，P=0.401；其他恶性肿瘤组 r=-0.117，P=0.373；BCS合并肝硬化组r=-0.047，P=0.747；肝良性肿瘤组r=-0.037，P=0.776； 健康志愿者组 r=-0.101，P=0.443。

3 讨论

本实验采用ELISA方法检测490例待检者的血清GP73水平，其血清中均能检测到GP73的表达，且HCC、胆管细胞癌、BCS合并HCC组中GP73表达水平明显高于其他各组，差异均有统计学意义（P＜0.05）。同时，与乙肝组相比，乙肝肝硬化组GP73表达水平较高，差异有统计学意义 （P＜0.05），但AFP水平差异并无统计学意义 （P＞0.05）；BCS并肝硬化组与BCS并HCC组相比，差异有统计学意义 （P＜0.05），与乙肝肝硬化组相比，GP73及AFP水平差异均无统计学意义（P＞0.05）；Spearman相关分析发现，血清GP73与AFP的表达水平之间没有相关性 （P＞0.05）。与AFP相比，GP73诊断肝细胞肝癌的AUC及灵敏度显著高于AFP（P＜0.05），GP73诊断胆管细胞癌的受试者工作特征曲线下面积为0.774，灵敏度、特异度及正确率分别为88.6%、72.7%及73.9%，而胆管细胞癌组中，AFP表达水平与健康志愿者相比无明显升高，差异无统计学意义（P＞0.05），故没有诊断价值。

本研究发现，肝硬化组GP73水平高于乙型肝炎组，HCC组GP73水平显著高于肝硬化组和乙型肝炎组，差异有统计学意义（P＜0.05）；显示GP73表达水平在由乙肝向乙肝肝硬化、HCC演化过程中逐渐升高，而AFP无此趋势变化，提示对于有乙肝、乙肝肝硬化的患者，若其血清GP73＞43.35 ng/ml，可给予其定期上腹部超声及CT检查，或将有助于HCC的早期诊断与治疗。

BCS合并HCC组的GP73表达水平明显高于BCS合并肝硬化组，差异有统计学意义（P＜0.05），提示GP73表达水平与BCS的发生、发展所导致的淤血性肝硬化，乃至HCC过程中造成的的肝细胞损害严重程度较重有关，符合Iftikhar等［9］提出两个关于GP73表达上调的机制：①是在由急性肝细胞损伤引发；②是慢性肝脏疾病的进展。提示对于BCS的患者，若其血清 GP73较高（＞43.35 ng/ml），同样可给予其定期上腹部超声及CT检查，或将有助于BCS合并HCC的早期诊断与治疗。

［1］ 徐海峰，杨华瑜，张宏冰，等.改变肝癌早期诊断和治疗现状的新肝癌血清标志物 ［J］.基础医学与临床，2008，28：104-108.

［2］ Hu JS， Wu DW， Liang S， et al.GP73， a resident Golgi glycoprotein，is sensibility and specificity for hepatocellular carcinomaofdiagnosisin ahepatitisB-endemicAsian population［J］.Med Oncol， 2010， 27： 339-345.

［3］ Marrero JA，Romano PR，Nikolaeva O，et al.GP73，a resident Golgi glycoprotein，is a novel serum marker for hepatocellular carcinoma［J］.Hepatology， 2005， 43： 1007-1012.

［4］ 韩新强，祖茂衡，顾玉明，等.布-加综合征合并肝癌36例临床分析［J］.介入放射学杂志，2011，20： 207-209.

［5］ 魏 宁，祖茂衡，徐 浩，等.下腔静脉膜型布加综合征合并原发性肝癌的影像学诊断和临床分析 （附14例病例）［C］.第六届国际布加综合征学术大会暨汪忠镐血管论坛，2010：710-711.

［6］ 程永德，程英升，颜志平，等.常见恶性肿瘤介入治疗指南［M］.北京：科学出版社，2013：69-73.

［7］ 中国人民共和国卫生部.原发性肝癌诊疗规范 （2011版）［J］.临床肿瘤学杂志，2011，16：929-946.

［8］ 中华医学会肝病学分会，中华医学会感染病学分会.慢性乙型肝炎防治指南 （2010年版）［J］.中西医结合肝病杂志，2010，21：121-122.

［9］ Iftikhar R，Kladney RD，Havlioglu N，et al.Disease-and cellspecific expression of GP73 in human liver disease ［J］.Am J Gastroenterol， 2004， 99： 1087-1095.