糖尿病大鼠骨髓来源内皮祖细胞体外生物学活性研究

魏黎明， 付银鑫， 朱悦琦， 鲁海涛， 王 珏， 程永德， 李晓聪，汪 泱， 赵俊功

内皮祖细胞 （endothelial progenitor cells，EPC）是一种骨髓来源的多能干细胞，因其具有修复损伤血管内皮层及生成新生血管作用，EPC在糖尿病血管系统并发症、脑卒中等缺血性疾病领域中的研究越来越多［1-2］。已有学者指出外周血EPC功能失调可能降低糖尿病患者的血管再生能力，糖尿病患者支架植入出现内皮化亦会延迟［3-4］。但对EPC在糖尿病患者或动物骨髓中的变化目前研究较少，是否也存在功能受损有待于进一步研究［5-6］。本研究探讨糖尿病大鼠骨髓来源EPC与正常大鼠在数量及生物学活性方面的差异，为提高糖尿病患者下肢血管病变介入治疗后的长期通畅率提供新的思路。

1 材料与方法

1.1 糖尿病大鼠模型的建立

雄性SD大鼠10只，SPF级，体重250～350 g，购于上海西普尔-必凯实验动物有限公司，实验动物生产许可证编号：SCXK（沪）2008-0016。将大鼠随机分为糖尿病组和对照组各5只。按说明书配置溶解（STZ，Sigma）的枸橼酸缓冲液，实验组大鼠禁食12 h后按60 mg/kg腹腔快速注射含1%STZ的枸橼酸缓冲液。对照组大鼠腹腔注射等量的枸橼酸-枸橼酸钠缓冲液。48 h后快速血糖仪检测大鼠随机血糖水平判定是否建模成功，判定标准为随机血糖浓度＞16.7 mmol/L，每周测定1次大鼠血糖水平及体重，直至实验结束全部处死。

1.2 EPC的分离和培养

大鼠骨髓来源EPC的分离、培养和鉴定方法按参考文献［7］。用PBS反复冲洗大鼠股骨和胫骨骨髓腔，梯度离心分离单个核细胞 （MNC），提取云雾状细胞层，加入EGMTM-2MV Bullet KitTM培养基（VA，USA），计数并调整细胞浓度后种入预先包被纤维连接蛋白 （Gene Operation，USA）的 6孔板，置于37℃、体积分数为0.05的CO2饱和湿度培养箱中培养，4 d后首次换液，去除未贴壁细胞，以后每3～4 d换液1次。细胞融合约90%进行传代。

1.3 EPC的鉴定及生物活性测定

1.3.1 流式细胞仪检测 EPC培养8 d后，重悬于含0.5%BSA的PBS，离心，4%多聚甲醛固定，BSAPBS再次重悬并分管，分别加入抗体CD34（R&D system，USA）、CD13 （Anti-PROM1 pAb，Abnova，USA）及血管内皮生长因子受体2（VEGFR-2，Abcam，USA），室温孵育30 min，加入各自配对二抗，室温避光孵育1 h后上流式细胞仪检测。

1.3.2 摄取Dil-Ac-LDL与结合FITC-UEA-1实验 取培养8 d的EPC，吸弃孔内液体，加入Dil-Ac-LDL（10 mg/L，Bicycle Technologies International，USA），置于培养箱中孵育4 h，以4%多聚甲醛固定后加入 FITC-UEA-1（10 mg/L，Sigma），继续置于培养箱中孵育1 h，以PBS漂洗后加入DAPI（Abcam，USA）染色，置于免疫荧光显微镜观察并拍照。能够同时摄取Dil-Ac-LDL与结合FITC-UEA-1的细胞被认为是正在分化的EPC。计数10个随机100倍视野的贴壁细胞，比较糖尿病大鼠骨髓来源EPC数量与正常大鼠的差异。

1.3.3 EPC黏附能力检测 0.25%胰蛋白酶消化原代EPC后重悬并接种于纤维连蛋白预包被的培养板中，培养箱孵育30 min，计数10个随机200倍视野的贴壁细胞。

1.3.4 EPC增殖能力检测 将原代EPC重悬细胞液转至96孔板，糖尿病组和对照组分别设计35个含细胞副孔，并设置7个无细胞副孔作空白对照，每孔约3 000个细胞，连续7 d，每天检测5个细胞孔及1个副孔的EPC增殖能力，检测时每孔加入CCK-8 试剂（Yeasen，China）后培养箱孵育 3 h，细胞上液转至另一96孔板，于酶标仪450 nm处测吸光度（A）。

1.3.5 EPC迁移能力测定 Transwell小盒（Corning，USA）膜底层提前包埋纤维连接蛋白2 h，原代EPC不含血清基础培养基重悬，上室加入100 μl细胞悬液，约3 000个细胞，下室加入700 μl含血清培养基，放置培养箱孵育14 h后吸取上室悬液，4%多聚甲醛1 ml固定30 min，棉签棒小心擦掉上层细胞，DAPI染色3 min，晾干，在免疫荧光显微镜下计数10个随机200倍视野的贴壁细胞。

1.4 统计学方法

应用SPSS20.0软件进行统计学分析，所有数据以均数 ±标准差表示，组间比较采用成组t检验，P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 糖尿病组和对照组大鼠血糖、体重变化

糖尿病组大鼠腹腔注射STZ后，逐渐出现多尿、多饮、多食、体重增速减缓，而对照组大鼠生长发育正常。注药后每周检测两组大鼠血糖水平及体重。糖尿病组大鼠血糖明显升高，体重增长速度明显减缓（图1），注射STZ后48 h血糖即明显升高，从（5.11 ± 0.35）mmol/L 升至（27.6 ± 3.34）mmol/L，此后一直维持高血糖状态，而对照组大鼠血糖一直维持正常值水平。另外，糖尿病组大鼠体重增速明显降低，2个月后体重从 （246.2±7.6）g升至（291.7 ± 13.7）g， 而对照组体重从 （251.1 ± 10.2）g升至（361.7 ± 16.2）g。

2.2 EPC形态学变化

两组大鼠EPC细胞形态无明显差异，刚分离的MNC均呈小圆形，约在培养4 d左右出现部分圆形细胞伸开突起，呈短梭形贴壁，形成细胞集落，细胞形态逐渐拉长，8 d后细胞生长旺盛，已较为密集，可见纺锤形、三角形等不同形态细胞，12 d左右细胞可完全铺满板孔，形态为梭形，呈“铺路石”样（图2，3）。

2.3 EPC鉴定

图1 注射尿链佐菌素后糖尿病组大鼠体重增长速度明显减缓（上图），血糖明显升高，且保持稳定状态（下图）

图2 糖尿病大鼠EPC培养过程中的形态变化（×100）

图3 对照组大鼠EPC培养过程中的形态变化（×100）

2.3.1 CD34、CD133和 VEGFR-2表达 经过 8 d培养的EPC固定后行免疫组化流式细胞术检测，结果显示两组CD34、CD133及VEGFR-2均呈阳性，阳性率占85%以上（图4）。

2.3.2 摄取Dil-Ac-LDL与结合FITC-UEA-1实验 免疫荧光显微镜下，EPC摄取Dil-Ac-LDL后胞质呈红色，结合FITC-UEA-1的胞质呈绿色，DAPI染色细胞核呈蓝色 （图5）。计数10个随机100倍视野的贴壁细胞。糖尿病组大鼠EPC数目为（102.2 ± 6.8）个，对照组大鼠为（105.6 ± 8.0）个，组间差异无统计学意义 （P＞0.05）。两组EPC培养24 d时，大部分细胞的Dil-Ac-LDL和FITC-UEA-1双染色仍呈双阳性。

图4 流式细胞仪检测糖尿病组（上排）和对照组大鼠（下排）EPC表面标志CD34、CDl33及VEGFR-2表达均呈阳性

图5 EPC的DiI-ac-LDL和FITC-UEA-1双染法鉴定（×400）

2.3.3 EPC黏附、增殖及迁移能力检测 取培养12 d的EPC作细胞生物功能测定，消化重悬后接种于培养板，30 min后置于倒置显微镜下随机采集10个200倍视野，并计数视野内贴壁细胞数量，糖尿病组和对照组EPCs贴壁细胞数目分别为 （16.7±2.2）个和（23.3±4.9）个，组间差异有统计学意义（P＜0.05），提示糖尿病组EPC黏附能力较对照组减少。从图6可见，连续7 d的A值表明对照组EPCs细胞活力高于糖尿病组，且活度保持较稳定，而糖尿病组EPC活力开始较低，随后有逐渐上升趋势，但仍较对照组细胞活度低，由此可见糖尿大鼠EPC增殖能力亦较正常大鼠减弱。14 h后经DAPI染色可见，糖尿病组和对照组细胞数目分别为（12.9±4.2）个和（17.1±6.1）个，组间差异有统计学意义（P＜0.05），提示糖尿病大鼠EPC迁移能力较正常大鼠亦减弱。

图6 两组大鼠EPCS增殖能力比较

3 讨论

EPC是一种来源于骨髓并可被动员进入外周血循环、具有分化为内皮细胞能力的干细胞，在血管损伤后受损，骨髓内的EPC可被动员入外周血并聚集至损伤部位黏附并分化为成熟的EPC，参与血管内皮化［7］。外周血的EPC数量下降，功能亦受损，包括氧化应激作用、NADPH氧化酶激活以及PI-3激酶/Akt通路激活失灵等［8-10］。相对于外周血，骨髓中的EPC含量是外周血的10～15倍，且增殖能力更强［11］，而骨髓是外周血EPC的来源，研究骨髓来源EPC的性质及功能对于揭示外周血EPC数量及功能下调具有重要意义。

本研究中，我们发现糖尿病大鼠EPC与正常大鼠在细胞形态上无明显区别，早期为短梭形或三角形贴壁多见，生长速率较慢，至第8天后生长速率明显增快，12 d左右即可铺满培养板，细胞逐渐呈长梭形改变，且逐渐增多，呈铺路石样外观，边界轮廓光滑，早期短梭形细胞逐渐少见。

EPC表面抗原标志物主要有造血谱系（CD34和 CD133）及内皮谱系（VEGFR-2，CD31 和 vWF）。一般认为，骨髓来源的早期EPC或者刚动员至血液循环的EPC通常表达 CD133、CD34和 VEGFR-2，而外周血的EPC主要表达CD34、VEGFR-2、CD31、VE-cadherin及vWF，随着EPC分化成熟，细胞逐渐丧失表达 CD133的能力，而开始表达vWF［12］。 目前认为主要通过CD34、CD133和VEGFR-2三种表面抗原鉴定EPC。本实验中，糖尿病和正常大鼠的EPC均培养至8 d后鉴定CD34、CD133和VEGFR-2，三者阳性率均大于85%，与之前报道结果相符，CD133仍呈高表达，提示其为早期未成熟的EPC。

EPC功能减退是糖尿病血管并发症发生的重要原因，正常情况下局部血管出现损伤或组织缺血后会释放生长因子，生长因子会促使骨髓EPC增殖并形成细胞集落，当骨髓EPC被动员至外周循环血管系统损伤处时可黏附至成熟的内皮表面，促进再内皮化及新生血管生成［13］。由于糖尿病引起的全身系统的病理生理变化，可导致EPC各项功能衰弱，以至血管损伤处内皮化不全，伤口愈合及新生血管速率减慢。

［1］ Chen J， Chen J， Chen S， et al.Transfusion of CXCR4-primed endothelial progenitor cells reduces cerebral ischemic damage and promotes repair in db/db diabetic mice ［J］.PLoS One，2012， 7： e50105.

［2］ Tatsumi T， Matsubara H.Therapeutic angiogenesis for peripheral arterial disease and ischemic heart disease by autologous bone marrow cells implantation ［J］.Nihon Rinsho， 2006， 64： 2126-2134.

［3］ Zhang W， Yan H.Dysfunction ofcirculating endothelial progenitor cells in type 1 diabetic rats with diabetic retinopathy［J］.Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol， 2013， 251： 1123-1131.

［4］ Pendyala LK， Yin X， Li J， et al.The first-generation drugeluting stents and coronary endothelial dysfunction ［J］.JACC Cardiovasc Interv， 2009， 2： 1169-1177.

［5］ Murayama T，Tepper OM，Silver M， et al.Determination of bone marrow-derived endothelial progenitor cell significance in angiogenic growth factor-induced neovascularization in vivo［J］.Exp Hematol， 2002， 30： 967-972.

［6］ 肖 亮，申 景，黄德生，等.糖尿病下肢动脉阻塞性病变介入治疗疗效分析［J］.介入放射学杂志，2011，20：218-223.

［7］ Massa M， Rosti V， Ferrario M， et al.Increased circulating hematopoietic and endothelial progenitor cells in the early phase of acute myocardial infarction［J］.Blood， 2005， 105： 199-206.

［8］ Sukpat S， Isarasena N， Wongphoom J， et al.Vasculoprotective effects of combined endothelial progenitor cells and mesenchymal stem cells in diabetic wound care：their potential role in decreasing wound-oxidative stress ［J］.Biomed Res Int， 2013，2013： 459196， doi： 10.1155/2013/459196.

［9］ Liu J， Zhang FF， Li L， et al.ClC-3 deficiency prevents apoptosis induced by angiotensinⅡin endothelial progenitor cells via inhibition of NADPH oxidase［J］.Apoptosis， 2013， 18：1262-1273.

［10］ Aicher A，Heeschen C，Mildner-Rihm C，et al.Essential role of endothelial nitric oxide synthase for mobilization of stem and progenitor cells［J］.Nat Med， 2003， 9： 1370-1376.

［11］ Hasegawa T， Kosaki A， Shimizu K， et al.Amelioration of diabetic peripheral neuropathy by implantation of hematopoietic mononuclear cells in streptozotocin-induced diabetic rats［J］.Exp Neurol， 2006， 199： 274-280.

［12］ Rustemeyer P， Wittkowski W， Jurk K， et al.Optimized flow cytometric analysis of endothelial progenitor cells in peripheral blood［J］.J Immunoassay Immunochem， 2006， 27： 77-88.

［13］ Kim KA， Shin YJ， Kim JH， et al.Dysfunction of endothelial progenitor cells under diabetic conditions and its underlying mechanisms［J］.Arch Pharm Res， 2012， 35： 223-234.