乳腺癌中乙醛脱氢酶1与上皮性钙黏蛋白、神经性钙黏蛋白关系的研究

蔡建英，吴诚义



乳腺癌中乙醛脱氢酶1与上皮性钙黏蛋白、神经性钙黏蛋白关系的研究

蔡建英，吴诚义

400016 重庆医科大学附属第一医院内分泌乳腺外科

乳腺癌干细胞是一类具有自我更新及多向分化潜能的原始细胞，在一定条件下可以分化成多种不同功能的细胞，从而影响乳腺癌的发生、发展、转移、耐药及复发等生物学行为[1]。上皮-间质转化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）在乳腺癌浸润转移过程中起着重要作用。本实验应用免疫组织化学方法研究乳腺癌干细胞标志物乙醛脱氢酶1（ALDH1）蛋白与 EMT 标志蛋白上皮性钙黏蛋白（E-cadherin）、神经性钙黏蛋白（N-cadherin）在正常乳腺组织、乳腺癌、转移性淋巴组织中的表达情况，探讨乳腺癌干细胞与乳腺癌浸润转移的关系。

1 材料与方法

1.1 样本

采集重庆医科大学附属第一医院 2010 年 9 月– 2011 年 12 月间行乳腺癌根治手术患者组织标本 40 例，同时收取肿大腋窝淋巴结 28 例，年龄 33 ~ 73 岁，平均 51.2 岁。收取本院 2011 年 9 – 11 月间行良性乳腺病变微创手术切缘组织 30 例作为正常乳腺组织标本。

1.2 主要试剂与仪器

ALDH1 兔抗人多克隆抗体购于美国Abcam 公司；兔抗人多克隆 E-cadherin 抗体及兔抗人多克隆 N-cadherin 抗体购于武汉博士德公司；SP 免疫组化染色试剂盒、DAB 显色试剂盒购于北京中杉金桥公司。2135 型轮转式组织切片机为德国Leica 公司产品；BX50 光学显微镜和 TVL 显微摄像系统均为日本 Olympus 公司产品。

1.3 方法

1.3.1 病理学检查 所有标本经 4% 甲醛溶液固定至少 24 h，石蜡包埋，4 μm 厚切片。根据病理学检测结果，将标本分为正常组（n = 28），乳腺癌组（n = 40），淋巴转移组（腋窝淋巴结癌转移，n = 26）。

1.3.2 免疫组化染色 采用免疫组化 SP 法染色。标本切片行脱蜡、梯度酒精水化、热抗原修复、血清封闭后，滴加一抗工作液（ALDH1 抗体工作液浓度为 1:100；E-cadherin 与 N-cadherin 抗体工作液浓度均为 1:50），4 ℃冰箱过夜，滴加辣根过氧化物酶标记二抗，DAB 显色，苏木精轻度复染，中性树脂封片。

1.3.3 结果判定 ALDH1 蛋白主要表达于细胞质，呈棕黄色。根据染色强度及显色细胞比例，对染色结果进行分级。按切片中细胞有无显色及显色深浅进行评分：无显色为 0 分，浅棕色为 1 分，深棕色为 2 分。按显色细胞比例进行评分：0%~ 10%为 0 分，11%~ 30%为 1 分，31%~ 70%为 2 分，> 71% 为 3 分。以上述两项评分之和作为每个患者的积分：0 分为阴性（–），l ~ 5 分为阳性（+）[2]。E-cadherin 表达采用半定量方法判断，以细胞膜内出现棕黄色颗粒为阳性表达，结果判读参照 Mahler-Araujo 等[3]的评分方法：阳性细胞 0% ~ < 10% 为 0 分，阳性细胞 10% ~ < 25% 为 1 分，阳性细胞 25% ~ < 50% 为 2 分，阳性细胞 50% ~ < 75% 为 3 分，阳性细胞≥ 75% 为 4 分，0 ~ 3 分为表达阴性，≥ 3 分为表达阳性。N-cadherin 表达采用半定量方法判断，以细胞膜和（或）细胞质内出现棕黄色颗粒为阳性表达，结果判读参照Lascombe 等[4]的评分方法：≥ 5%为表达阳性，< 5%为表达阴性。

1.4 统计学处理

采用 SPSS17.2 软件进行统计学分析，计数资料用2检验，以= 0.05 为检验水准，以< 0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 ALDH1、E-cadherin、N-cadherin 在不同组织中的表达

ALDH1 表达于乳腺癌组织细胞质中，在正常乳腺组织中不表达；在 28 例正常乳腺组织、40 例乳腺癌组织及26 例腋窝转移淋巴组织分别表达 0 例（0.0%）、8 例（20.0%）、9 例（34.6%），其表达差异具有统计学意义（= 0.004）。在正常乳腺组织中，E-cadherin 主要表达于细胞膜，呈棕黄色，少量表达于细胞质。随着乳腺组织癌变及转移发生，E-cadherin 逐渐降低，且主要表达于细胞质；在 28 例正常乳腺组织、40 例乳腺癌组织及 26 例腋窝转移淋巴组织分别表达 28 例（100.0%）、22 例（55.0%）、8 例（30.8%），其表达差异具有统计学意义（= 0.000）。N-cadherin 主要表达于癌组织细胞质中，呈棕黄色，少量表达于细胞膜，在正常乳腺组织中不表达。随着乳腺组织癌变及转移，N-cadherin 表达逐渐上调，且出现细胞膜表达增强。在28 例正常乳腺组织、40 例乳腺癌组织及 26 例腋窝转移淋巴组织中分别表达 0 例（0.0%）、19 例（47.5%）、19 例（73.1%），其表达差异具有统计学意义（= 0.000）（表 1和图 1）。

表 1 ALDH1、E-cadherin、N-cadherin 在不同组织中的表达

图 1 免疫组织化学法检测 ALDH1、E-cadherin、N-cadherin 在不同组织中的表达（× 400）（A：ALDH1 在正常乳腺组织中呈阴性表达；B：ALDH1 在乳腺癌组织中呈阳性表达；C：ALDH1 在腋窝转移淋巴组织中呈阳性表达；D：E-cadherin 在正常乳腺组织中呈阳性表达；E：E-cadherin 在乳腺癌组织中呈阴性表达；F：E-cadherin 在腋窝转移淋巴组织中呈阴性表达；G：N-cadherin 在正常乳腺组织中呈阴性表达；H：N-cadherin 在乳腺癌组织中呈阳性表达；I：N-cadherin 在腋窝转移淋巴组织中呈阳性表达）

2.2 乳腺癌中 ALDH1 与 E-cadherin、N-cadherin 的关系

在 22 例 E-cadherin阳性表达乳腺癌中，ALDH1 阳性表达 1 例（4.5%），18 例E-cadherin阴性表达乳腺癌中 ALDH1阳性表达 7 例（38.9%），其表达差异具有统计学意义（= 0.007）。在 19 例 N-cadherin阳性表达乳腺癌中，ALDH1阳性表达 7 例（36.8%），21 例 N-cadherin阴性表达乳腺癌中 ALDH1阳性表达 1 例（4.8%），其表达差异具有统计学意义（= 0.011）（表 2）。

表 2 乳腺癌中 ALDH1 与 E-cadherin、N-cadherin表达的关系

3 讨论

2003 年，AI-Hajj 等[5]最先证实了乳腺癌干细胞的存在。在乳腺癌患者转移性胸腔积液中分离得到一类表型为 CD44+/CD24-/low 的乳腺癌细胞，此类细胞具有自我更新、多向分化潜能及强致瘤性等特征，符合肿瘤干细胞的特征。2007 年，Ginestier 等[6]通过成瘤实验发现 ALDH1 阳性乳腺癌细胞具有极强的成瘤能力，从而利用 ALDH1 在乳腺癌组织中分离鉴定出乳腺癌干细胞。ALDH1+及 CD44+/CD24-/low 表型是目前研究比较成熟的乳腺癌干细胞标志物。

乳腺癌干细胞是一群具有自我更新及多向分化潜能的原始细胞亚群，而浸润及转移亦是乳腺癌干细胞的特征之一。EMT 是指上皮细胞在正常生理和特定病理情况下向间充质细胞转（分）化的现象，该上皮细胞失去极性，经过细胞骨架重塑，转变成具有迁移能力的间充质表型的过程[7]，是肿瘤细胞发生浸润转移的基础。在此过程中癌细胞丧失上皮细胞特性并同时获得间质细胞的某些特性，游走能力及与周围或远处间质组织亲和能力增强，从而使肿瘤细胞发生转移。E-cadherin 及 N-cadherin 的异常表达在 EMT 过程中起到了重要作用。E-cadherin 主要分布于胚胎组织和成熟组织的上皮细胞中，具有促进细胞黏附聚集、保持上皮形态及结构完整、参与细胞分化和细胞极性等重要作用。而 N-cadherin 仅表达于神经外胚层和中胚层来源的组织，正常上皮组织不表达。N-cadherin 在上皮组织中的异位表达可促进肿瘤细胞的浸润和转移，而且其作用超过 E-cadherin 介导的细胞黏附作用。Wheelock 等[8]认为在发生 EMT 过程中“钙黏蛋白转换”（cadherin switch）也起到重要作用，即肿瘤细胞中 E-cadherin 表达下调，同时向间质细胞形态转化；而间充质细胞标志物 N-cadherin 表达上调，促进上皮细胞与间质黏附，使细胞获得运动迁移能力。本研究中发现，正常乳腺组织-乳腺癌-癌转移性淋巴组织中，E-cadherin 表达逐渐减少，而 N-cadherin 表达逐渐增加，且各组间表达有差异性（< 0.05）。

近年有学者研究发现，EMT 过程可诱导乳腺癌干细胞 CD44+/CD24-/low 表型表达增加[9]。Mani 等[10]发现非肿瘤乳腺上皮细胞经历 EMT 后，E-cadherin 表达下调而N-cadherin 上调，同时 CD44+/CD24-/low 表型细胞增多，因此，认为 EMT 可以诱导乳腺癌产生具有CD44+/CD24-/low 表型的细胞。包俊杰和吴诚义[11]通过检测正常乳腺组织、癌旁乳腺组织、乳腺癌组织及癌转移性腋窝淋巴组织 E-cadherin、N-cadherin 及 CD44/CD24 的表达情况，亦认为经历 EMT 过程后，CD44+/CD24-/low 表型表达增加。韩明利等[12]发现 EMT 还可诱导乳腺癌 MCF-7 细胞中 ALDH1 的表达增加。本研究结果显示，正常乳腺组织、乳腺癌及转移性淋巴几种组织类型中，ALDH1 表达逐渐增加，E-cadherin 表达逐渐减少，N-cadherin 表达逐渐增加，且差异有统计学意义（< 0.05）。在乳腺癌组织中， ALDH1表达与 E-cadherin、N-cadherin 的表达存在相关性（< 0.05）。

综上所述，本研究发现 EMT 过程中存在“钙黏蛋白转换”过程，即：正常乳腺组织-乳腺癌-癌转移性淋巴组织中，E-cadherin 表达逐渐减少，而 N-cadherin 表达逐渐增加。ALDH1 在 EMT 过程中表达逐渐增加，且与 E-cadherin 及 N-cadherin 表达存在相关性。EMT 过程是否会诱导 ALDH1阳性表型乳腺癌干细胞表达增加尚需进一步研究。

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吴诚义，Email：NFMWK1192@hospital-cqmu.com

2013-12-16

10.3969/cmba.j.issn.1673-713X.2014.03.015