希金斯炭疽菌14—3—3蛋白质生物信息学分析

摘要：希金斯炭疽菌（Colletotrichum higginsanum Sacc.）可以侵染菜心、萝卜等十字花科蔬菜引起炭疽病，不仅降低蔬菜的产量，还影响蔬菜的品质。基于酿酒酵母中2个典型14-3-3蛋白质序列，利用Blastp以及关键词对炭疽菌属蛋白质数据库进行搜索，明确该菌存在2个典型的14-3-3蛋白质，分别命名为ChFTT1、ChFTT2；对这两个蛋白质进行理化性质、二级结构、疏水性、信号肽、跨膜结构域以及亚细胞定位等生物信息学分析，可为深入研究希金斯炭疽菌14-3-3蛋白质功能提供参考。

关键词：希金斯炭疽菌（Colletotrichum higginsanum Sacc.）；14-3-3蛋白质；信号肽；二级结构；亚细胞定位

中图分类号：S435.1 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2014）15-3669-04

Bioinformatics Analysis of 14-3-3 Protein in Colletotrichum higginsianum Sacc.

HAN Chang-zhi

（College of Forestry， Southwest Forestry University/The Key Laboratory of Forest Disaster Warning and

Control of Yunnan Province， Kunming 650224， China）

Abstract： Colletotrichum higginsianum Sacc. can infect flowering Chinese cabbage， carrot and other cruciferous vegetables， reduce the production of vegetables and affect the quality of vegetables. Based on two typical 14-3-3 protein sequences in Saccharomyces cerevisiae， 14-3-3 related protein sequence was searched from the protein databases of Colletotrichum spp. with the Blastp. Two typical ones named as ChFTT1 and ChFTT2 were identified in C. higginsianum Sacc. Bioinformatics analysis of 14-3-3 proteins including physicochemical properties， the secondary structure， hydrophobic， the signal peptide， trans-membrane domain structure and sub-cellular localization were made. This study will play theoretical foundation for studying the function of 14-3-3 protein in C. higginsianum Sacc.

Key words： Colletotrichum higginsianum Sacc.； 14-3-3 protein； signal peptide； secondary structure； sub-cellular localization

收稿日期：2013-11-20

基金项目：云南省森林灾害预警与控制重点实验室开放基金项目（ZK11A101；ZK11SB01）；云南省教育厅科学研究基金项目（2014Y330）

作者简介：韩长志（1981-），男，河北石家庄人，讲师，博士，主要从事经济林木病害生物防治与真菌分子生物学研究，（电话）15877923075（电子信箱）

hanchangzhi@gmail.com。

希金斯炭疽菌（Colletotrichum higginsanum Sacc.）可以侵染菜心、萝卜、小油菜、大白菜以及羽衣甘蓝等多种十字花科蔬菜，引起炭疽病，是一类重要的世界性植物病害[1-3]。在我国，菜心炭疽病是菜心上最常见和发生最严重的病害之一，该菌也成为限制菜心产量和质量的重要因子[4]。14-3-3蛋白质是由Moore等[5]于1967年首次从牛脑组织中分离得到的一种酸性可溶性蛋白质，其作为结合蛋白质广泛存在于拟南芥、水稻、番茄等真核生物中[6]。在植物中，该蛋白质可参与赤霉素、脱落酸、油菜素类固醇化合物以及乙烯等植物激素信号通路转导、MAPK、营养代谢调控和光信号应答等过程[7，8]。此外，该蛋白质还参与植物对渗透胁迫[9]、病原胁迫[10]等多种胁迫的应答。

目前，学术界对希金斯炭疽菌中14-3-3蛋白质的研究尚未见报道。因此，本研究基于酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）中存在的2个典型14-3-3蛋白质（Bmh1、Bmh2）序列[11]，通过对炭疽菌属蛋白质数据库Blastp比对及关键词搜索，以期明确希金斯炭疽菌中14-3-3蛋白质的分布情况，同时，通过生物信息学分析，研究14-3-3蛋白质的基本理化性质、疏水性以及亚细胞定位情况、二级结构特征等，为进一步深入开展该蛋白的功能研究打下基础。

1 材料与方法

1.1 材料

根据酿酒酵母S288c中Bmh1、Bmh2氨基酸序列，利用炭疽菌属蛋白质数据库（http：//www.broadinstitute.org/annotation/genome/colletotrichum_group/MultiHome.html）进行在线Blastp比对[12]，E-value选择1e-50，其他参数均选择默认值，获得希金斯炭疽菌中所含有的候选14-3-3蛋白质，同时，通过输入“14-3-3”，在上述数据库中进行检索；另外，利用NCBI（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov）明确该菌中14-3-3蛋白质登录号的信息。endprint

1.2 方法[13]

1.2.1 保守结构域预测 利用SMART网站在线分析希金斯炭疽菌中14-3-3所具有的保守结构域特征。

1.2.2 蛋白质理化性质预测 利用蛋白质数据库（http：//www.expasy.ch/tools/protparam.html）在线进行分析，预测14-3-3的等电点、分子质量及氨基酸组成等理化性质。

1.2.3 蛋白质二级结构 采用PHD（http：//www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2/html/page.cgi？id=index）在线分析蛋白质的二级结构。

1.2.4 蛋白质疏水性预测 利用Protscale程序（http：//web.expasy.org/protscale/）在线分析蛋白质的疏水性。

1.2.5 蛋白质转运肽及信号肽预测 利用TargetP 1.1 Server（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TargetP/）在线分析预测蛋白质转运肽。同时，利用SignalP 3.0 Server（http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP-3.0/）在线分析预测蛋白质信号肽，该网站提供两种计算蛋白质信号肽的算法，一种是隐马可夫模型（Hidden markov models， HMM），另一种是神经网络方法（Neural Networks， NN）。对上述两种方法所预测的蛋白质信号肽结果进行分析。

1.2.6 跨膜区结构预测 利用TMHMM Server v. 2.0（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/）在线分析预测跨膜区结构。

1.2.7 亚细胞定位分析 利用ProtComp v9.0（http：//linux1.softberry.com/berry.phtml？topic=protcompan&group=programs&subgroup=proloc）在线进行亚细胞定位分析。

2 结果与分析

2.1 希金斯炭疽菌含有2个典型的14-3-3蛋白质

在炭疽菌属蛋白质数据库中，利用Blastp比对分析以及关键词搜索，发现希金斯炭疽菌中存在2个候选的14-3-3蛋白质，其ID为CH063_00205.1、CH063_11444.1（表1）。经过SMART分析结果（图1）表明，这两个序列均含有保守的14-3-3结构域，因此，根据其氨基酸大小以及英文缩写（14-3-3， Fourteen-Three-Three），将其分别命名为ChFTT2和ChFTT1。

2.2 蛋白质理化性质分析

希金斯炭疽菌中2个14-3-3的氨基酸数量差别不大，其相对分子质量、分子式以及原子数量也相差不多（表2）。ChFTT1、ChFTT2的理论等电点分别为4.81、4.77，均属于酸性氨基酸，上述蛋白质的半衰期较为一致，均为30 h。尽管2个14-3-3蛋白质的不稳定性系数有一定的差别，但其均大于40，属于不稳定蛋白质。另外，上述两个14-3-3蛋白质的亲水性均为负值。表明，希金斯炭疽菌中的ChFTT1、ChFTT2均属于亲水性蛋白质。

2.3 蛋白质疏水性分析

利用Protscale程序进行分析，结果表明，希金斯炭疽菌中存在的2个14-3-3蛋白质疏水性情况不同，ChFTT1中位于257位的甘氨酸（E），其亲水性最强，为-2.432，而位于175位的亮氨酸（S），其亲水性最弱（疏水性最强，下同），为0.853；ChFTT2中位于121位的蛋氨酸（H），其亲水性最强，为 -1.626，而位于177位的丙氨酸（S），其亲水性最弱，为0.989（图2）；ChFTT1、ChFTT2亲水性氨基酸残基数值总和分别为-160.308、-137.117，其疏水性氨基酸残基总和分别为10.984、17.489。希金斯炭疽菌中2个14-3-3蛋白质的疏水性有所差异，但均为亲水性蛋白质，这与通过理化性质分析得到的总平均亲水性GRAVY（Grand average of hydropathicity）结果一致。

2.4 转运肽及信号肽特征

通过分析（表3）表明，希金斯炭疽菌中的ChFTT1、ChFTT2均可以定位在细胞质中，其中，ChFTT1在分泌途径信号肽的预测值为0.924，其概率大于0.8，在叶绿体转运肽、线粒体目标肽的预测值分别为0.059、0.090；ChFTT2在分泌途径信号肽的预测值为0.907，其概率大于0.8，在叶绿体转运肽、线粒体目标肽的预测值分别为0.072、0.107。

经过SingnalP 3.0分析，ChFTT1、ChFTT2经NN和HMM预测均不具有信号肽序列。

2.5 二级结构预测

将希金斯炭疽菌的2个14-3-3蛋白质氨基酸序列分别输入PHD蛋白质二级结构预测网站获得其二级结构信息，结果表明，2个14-3-3蛋白质均含有α螺旋结构和无规卷曲，均不含有β转角，其中α螺旋结构所占比例较高（图3、图4）。

2.6 跨膜区结构分析

经过TMHMM在线分析，并未发现希金斯炭疽菌中2个14-3-3蛋白质含有典型的跨膜区结构，这与通过SMART在线分析所获得的结果一致。

2.7 亚细胞定位分析

目前，研究者对植物中14-3-3蛋白质的细胞定位研究发现，不同物种的蛋白质定位不同，主要集中在细胞核[14]、细胞质[15]、膜或其他细胞腔隙中[16]等。通过TMHMM在线分析发现，希金斯炭疽菌中2个14-3-3蛋白质的亚细胞定位情况相同，均定位于细胞质中（表4），在细胞核、胞外、线粒体、内质网以及高尔基体中均无定位，这与对禾谷炭疽菌14-3-3蛋白质亚细胞定位情况一致（待发表）。endprint

3 结论与讨论

目前，希金斯炭疽菌全基因组序列已经公布，对深入解析其致病相关因子，针对上述致病因子为作用靶标的防治药剂开发具有重要意义。目前，对植物中的14-3-3蛋白质的功能研究较多，而关于真菌中该蛋白质的研究较为少见。因此，本研究通过利用酿酒酵母中已经报道的2个14-3-3蛋白质的氨基酸序列（Bmh1、Bmh2），在炭疽菌属蛋白质数据库中进行Blastp比对，以及通过搜索关键词等方法，获得希金斯炭疽菌中2个典型的14-3-3蛋白质氨基酸序列。基于上述氨基酸序列，利用生物信息学分析网站对其理化性质、信号肽情况以及跨膜区等进行分析，初步明确了该蛋白质所具有的理化特性、亚细胞定位情况，为今后开展该菌蛋白质的功能研究提供了理论参考。

参考文献：

[1] 沈瑞清，张 萍，郭成瑾，等.宁夏炭疽菌属真菌资源研究[J].河南农业科学，2012 （5）：100-102，149.

[2] 梁惠凌，唐 辉.广西常见花卉真菌性病害的防治[J].广西园艺， 2002（2）：18-19.

[3] HYDE K，CAI L，CANNON P et al.Colletotrichum -names in current use[J].Fungal Diversity，2009（39）：147-182.

[4] 卢博彬，杨 暹.菜心炭疽病研究进展[J].长江蔬菜，2009（24）： 1-5.

[5] MOORE B，PEREZ V.Specific acidic proteins of the nervous system[A].CARLSON F D. Physiological and Biochemical Aspects of Nervous Integration[C].New Jersey，Englewood Cliffs：Prentice-Hall， 1967.343-359.

[6] FERL R J，MANAK M S，REYES M F.The 14-3-3s[J]. Genome Biology，2002，3（7）：1-7.

[7] 周 颖，李冰樱，李学宝.14-3-3蛋白对植物发育的调控作用[J].植物学报，2012（1）：55-64.

[8] DENISON F C，PAUL A L，ZUPANSKA A K，et al.14-3-3 proteins in plant physiology[J].Seminars in Cell & Developmental Biology，2011，22（7）：720-727.

[9] BABAKOV A V，CHELYSHEVA V V，KLYCHNIKOV O I，et al. Involvement of 14-3-3 proteins in the osmotic regulation of H+-ATPase in plant plasma membranes[J]. Planta， 2000， 211（3）：446-448.

[10] YAO Y， DU Y，JIANG L，et al.Molecular analysis and expression patterns of the 14-3-3 gene family from Oryza sativa[J]. Journal of Biochemistry and Molecular Biology， 2007， 40（3）： 349-357.

[11] VAN HEUSDEN G P H， YDE STEENSMA H. Yeast 14-3-3 proteins[J]. Yeast， 2006， 23（3）： 159-171.

[12] ALTSCHUL S F， MADDEN T L， SCHAFFER A A， et al. Gapped BLAST and PSI-BLAST： A new generation of protein database search programs[J]. Nucleic Acids Research， 1997， 25（17）： 3389-3402.

[13] 韩长志.禾谷炭疽菌14-3-3蛋白生物信息学分析[J].河南师范大学学报（自然科学版），2014，42（3）：109-114，118.

[14] PAUL A L， SEHNKE P C， FERL R J. Isoform-specific subcellular localization among 14-3-3 proteins in Arabidopsis seems to be driven by client interactions[J]. Molecular Biology of the Cell， 2005， 16（4）： 1735-1743.

[15] DE VETTEN N C， FERL R J. Two genes encoding GF14 （14-3-3） proteins in Zea mays （structure， expression， and potential regulation by the G-box-binding complex）[J]. Plant Physiology， 1994， 106（4）： 1593-1604.

[16] BIHN E A， PAUL A L，WANG S W，et al.Localization of 14-3-3 proteins in the nuclei of arabidopsis and maize[J]. The Plant Journal，1997，12（6）：1439-1445.endprint

3 结论与讨论

目前，希金斯炭疽菌全基因组序列已经公布，对深入解析其致病相关因子，针对上述致病因子为作用靶标的防治药剂开发具有重要意义。目前，对植物中的14-3-3蛋白质的功能研究较多，而关于真菌中该蛋白质的研究较为少见。因此，本研究通过利用酿酒酵母中已经报道的2个14-3-3蛋白质的氨基酸序列（Bmh1、Bmh2），在炭疽菌属蛋白质数据库中进行Blastp比对，以及通过搜索关键词等方法，获得希金斯炭疽菌中2个典型的14-3-3蛋白质氨基酸序列。基于上述氨基酸序列，利用生物信息学分析网站对其理化性质、信号肽情况以及跨膜区等进行分析，初步明确了该蛋白质所具有的理化特性、亚细胞定位情况，为今后开展该菌蛋白质的功能研究提供了理论参考。

参考文献：

[1] 沈瑞清，张 萍，郭成瑾，等.宁夏炭疽菌属真菌资源研究[J].河南农业科学，2012 （5）：100-102，149.

[2] 梁惠凌，唐 辉.广西常见花卉真菌性病害的防治[J].广西园艺， 2002（2）：18-19.

[3] HYDE K，CAI L，CANNON P et al.Colletotrichum -names in current use[J].Fungal Diversity，2009（39）：147-182.

[4] 卢博彬，杨 暹.菜心炭疽病研究进展[J].长江蔬菜，2009（24）： 1-5.

[5] MOORE B，PEREZ V.Specific acidic proteins of the nervous system[A].CARLSON F D. Physiological and Biochemical Aspects of Nervous Integration[C].New Jersey，Englewood Cliffs：Prentice-Hall， 1967.343-359.

[6] FERL R J，MANAK M S，REYES M F.The 14-3-3s[J]. Genome Biology，2002，3（7）：1-7.

[7] 周 颖，李冰樱，李学宝.14-3-3蛋白对植物发育的调控作用[J].植物学报，2012（1）：55-64.

[8] DENISON F C，PAUL A L，ZUPANSKA A K，et al.14-3-3 proteins in plant physiology[J].Seminars in Cell & Developmental Biology，2011，22（7）：720-727.

[9] BABAKOV A V，CHELYSHEVA V V，KLYCHNIKOV O I，et al. Involvement of 14-3-3 proteins in the osmotic regulation of H+-ATPase in plant plasma membranes[J]. Planta， 2000， 211（3）：446-448.

[10] YAO Y， DU Y，JIANG L，et al.Molecular analysis and expression patterns of the 14-3-3 gene family from Oryza sativa[J]. Journal of Biochemistry and Molecular Biology， 2007， 40（3）： 349-357.

[11] VAN HEUSDEN G P H， YDE STEENSMA H. Yeast 14-3-3 proteins[J]. Yeast， 2006， 23（3）： 159-171.

[12] ALTSCHUL S F， MADDEN T L， SCHAFFER A A， et al. Gapped BLAST and PSI-BLAST： A new generation of protein database search programs[J]. Nucleic Acids Research， 1997， 25（17）： 3389-3402.

[13] 韩长志.禾谷炭疽菌14-3-3蛋白生物信息学分析[J].河南师范大学学报（自然科学版），2014，42（3）：109-114，118.

[14] PAUL A L， SEHNKE P C， FERL R J. Isoform-specific subcellular localization among 14-3-3 proteins in Arabidopsis seems to be driven by client interactions[J]. Molecular Biology of the Cell， 2005， 16（4）： 1735-1743.

[15] DE VETTEN N C， FERL R J. Two genes encoding GF14 （14-3-3） proteins in Zea mays （structure， expression， and potential regulation by the G-box-binding complex）[J]. Plant Physiology， 1994， 106（4）： 1593-1604.

[16] BIHN E A， PAUL A L，WANG S W，et al.Localization of 14-3-3 proteins in the nuclei of arabidopsis and maize[J]. The Plant Journal，1997，12（6）：1439-1445.endprint

3 结论与讨论

目前，希金斯炭疽菌全基因组序列已经公布，对深入解析其致病相关因子，针对上述致病因子为作用靶标的防治药剂开发具有重要意义。目前，对植物中的14-3-3蛋白质的功能研究较多，而关于真菌中该蛋白质的研究较为少见。因此，本研究通过利用酿酒酵母中已经报道的2个14-3-3蛋白质的氨基酸序列（Bmh1、Bmh2），在炭疽菌属蛋白质数据库中进行Blastp比对，以及通过搜索关键词等方法，获得希金斯炭疽菌中2个典型的14-3-3蛋白质氨基酸序列。基于上述氨基酸序列，利用生物信息学分析网站对其理化性质、信号肽情况以及跨膜区等进行分析，初步明确了该蛋白质所具有的理化特性、亚细胞定位情况，为今后开展该菌蛋白质的功能研究提供了理论参考。

参考文献：

[1] 沈瑞清，张 萍，郭成瑾，等.宁夏炭疽菌属真菌资源研究[J].河南农业科学，2012 （5）：100-102，149.

[2] 梁惠凌，唐 辉.广西常见花卉真菌性病害的防治[J].广西园艺， 2002（2）：18-19.

[3] HYDE K，CAI L，CANNON P et al.Colletotrichum -names in current use[J].Fungal Diversity，2009（39）：147-182.

[4] 卢博彬，杨 暹.菜心炭疽病研究进展[J].长江蔬菜，2009（24）： 1-5.

[5] MOORE B，PEREZ V.Specific acidic proteins of the nervous system[A].CARLSON F D. Physiological and Biochemical Aspects of Nervous Integration[C].New Jersey，Englewood Cliffs：Prentice-Hall， 1967.343-359.

[6] FERL R J，MANAK M S，REYES M F.The 14-3-3s[J]. Genome Biology，2002，3（7）：1-7.

[7] 周 颖，李冰樱，李学宝.14-3-3蛋白对植物发育的调控作用[J].植物学报，2012（1）：55-64.

[8] DENISON F C，PAUL A L，ZUPANSKA A K，et al.14-3-3 proteins in plant physiology[J].Seminars in Cell & Developmental Biology，2011，22（7）：720-727.

[9] BABAKOV A V，CHELYSHEVA V V，KLYCHNIKOV O I，et al. Involvement of 14-3-3 proteins in the osmotic regulation of H+-ATPase in plant plasma membranes[J]. Planta， 2000， 211（3）：446-448.

[10] YAO Y， DU Y，JIANG L，et al.Molecular analysis and expression patterns of the 14-3-3 gene family from Oryza sativa[J]. Journal of Biochemistry and Molecular Biology， 2007， 40（3）： 349-357.

[11] VAN HEUSDEN G P H， YDE STEENSMA H. Yeast 14-3-3 proteins[J]. Yeast， 2006， 23（3）： 159-171.

[12] ALTSCHUL S F， MADDEN T L， SCHAFFER A A， et al. Gapped BLAST and PSI-BLAST： A new generation of protein database search programs[J]. Nucleic Acids Research， 1997， 25（17）： 3389-3402.

[13] 韩长志.禾谷炭疽菌14-3-3蛋白生物信息学分析[J].河南师范大学学报（自然科学版），2014，42（3）：109-114，118.

[14] PAUL A L， SEHNKE P C， FERL R J. Isoform-specific subcellular localization among 14-3-3 proteins in Arabidopsis seems to be driven by client interactions[J]. Molecular Biology of the Cell， 2005， 16（4）： 1735-1743.

[15] DE VETTEN N C， FERL R J. Two genes encoding GF14 （14-3-3） proteins in Zea mays （structure， expression， and potential regulation by the G-box-binding complex）[J]. Plant Physiology， 1994， 106（4）： 1593-1604.

[16] BIHN E A， PAUL A L，WANG S W，et al.Localization of 14-3-3 proteins in the nuclei of arabidopsis and maize[J]. The Plant Journal，1997，12（6）：1439-1445.endprint