和田枣中黄酮与多糖的超声提取及抗氧化分析

黄六容+张笑宇+王继华+梁徽铁+陈文瑞

摘要：研究了超声提取对和田枣（Zizyphus jujuba Mill.）中黄酮与多糖提取得率的影响，并分析了其抗氧化能力。采用不同的超声功率和时间提取和田枣中的黄酮与多糖，通过总还原力、羟基（·OH）清除率和1，1-二苯基-2-苦基肼（DPPH·）清除率来评价黄酮与多糖的抗氧化能力。结果表明，黄酮的最佳超声提取条件为600 W处理20 min，此时黄酮得率为0.88%；多糖在400 W处理30 min时获得最大得率为2.32%；在一定浓度范围内，黄酮与多糖的总还原力、·OH清除率和DPPH·清除率均与含量呈正相关，说明和田枣中黄酮与多糖具有较强的抗氧化能力。

关键词：和田枣（Zizyphus jujuba Mill.）；多糖；黄酮；超声提取；抗氧化性

中图分类号：TS255.4 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2014）15-3606-03

The Ultrasonic Extraction and Antioxidant Activity of Flavonoids and

Polysaccharides from Hetian Jujube

HUANG Liu-rong，ZHANG Xiao-yu，WANG Ji-hua，LIANG Hui-tie，CHEN Wen-rui

（Department of Food and Biological Engineering， Jiangsu University， Zhenjiang 212013，Jiangsu， China）

Abstract：The yields of flavonoids and polysaccharides extracted from Hetian jujube（Zizyphus jujuba Mill.） by ultrasound were studied， and their antioxidant activity were analyzed. The effects of different ultrasonic power and time on yields of flavonoids and polysaccharides were investigated. The antioxidant activity of flavonoids and polysaccharides were analyzed by measuring reducing power， the ratios of scavenging hydroxyl radical（·OH） and 1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl radica（DPPH·）. Results showed that when Hetian jujube powder was treated with ultrasound at 600 W for 20 min， the highest yield of flavonoids was achieved with the value of 0.88%. For polysaccharides， the optimal ultrasound conditions were power of 400 W and time of 30 min. Under these conditions， the yield of polysaccharides was 2.32%. The reducing power，·OH and DPPH· radical scavenging activities of flavonoids and polysaccharides were steadily increased with the increase of the sample amount. It is indicated that flavonoids and polysaccharides from Hetian jujube have good antioxidant activity.

Key words： Hetian jujube（Zizyphus jujuba Mill.）； flavonoids； polysaccharides； ultrasonic extraction； antioxidant activity

收稿日期：2014-01-10

基金项目：江苏高校优势学科建设工程资助项目（PAPD）；江苏大学大学生科研立项资助项目（1203000495）

作者简介：黄六容（1979-），女，湖北武穴人，讲师，博士，主要从事食品生物技术研究，（电话）13775554336（电子信箱）hlr88888@163.com。

黄酮和多糖类化合物具有抗氧化、抗衰老、降血脂、提高免疫力、促进记忆和改善睡眠等多种功效，广泛用于医药、保健品、美容产品等领域[1，2]。和田枣（Zizyphus jujuba Mill.）为新疆和田地区产的鼠李科枣属植物的成熟果实，其营养丰富，含糖类、蛋白质、脂肪及多种矿物元素，具有滋阴补肾、强身健体、软化血管、开胃健脾等多种功效[3]，而且枣类价格低、安全性高，对其进行合理的开发利用具有重要意义。超声波作用有助于破坏细胞壁膜和生物大分子，加速有效成分的扩散[4，5]，超声波在有机物的提取中有着广泛的应用[6，7]。本研究的目的是探索超声条件对和田枣中的黄酮和多糖得率的影响，并分析所得产物的抗氧化能力，为和田枣黄酮和多糖的研究与开发利用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

四星级新疆和田枣购于淘宝网。1，1-二苯基-2-苦基肼（DPPH·）购于Sigma 公司；其他试剂均购于国药集团化学试剂有限公司，且均为分析纯。endprint

GA92-ⅡD型超声细胞破碎（无锡上佳生物技术有限公司）；Unic7200型可见分光光度计（尤尼柯（上海）仪器有限公司；BUCHI/R210型旋转蒸发仪，瑞士BUCHI实验室技术服务有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 和田枣中黄酮的提取 将和田枣去核，50 ℃烘干后粉碎过80目筛，取4 g枣粉，置于100 mL高脚烧杯中，然后加入80 mL 80%乙醇，25 ℃水浴保持10 min。一组于400 W分别超声处理5、10、20、30、40 min，工作间歇比为2 s∶2 s；另一组在功率为100、200、400、600、1 000 W的条件下分别超声处理20 min，工作间歇比为2 s∶2 s。超声处理后，4 000 r/min离心10 min，收集滤液，滤渣继续加80 mL 80%乙醇提取1次，合并滤液，在50 ℃下旋转蒸发浓缩至50 mL，备用。收集黄酮提取后的滤渣，于40 ℃下干燥、称重、粉碎并过80目筛，用于多糖的提取。

1.2.2 和田枣中多糖的提取 称取4 g黄酮提取后的滤渣，置于100 mL高脚烧杯中，加入80 mL去离子水，25 ℃水浴保持10 min。一组于400 W时分别超声处理5、10、20、30、40 min，工作间歇比为2 s∶2 s；另一组在功率分别为100、200、400、600、1 000 W的条件下超声处理30 min，工作间歇比为2 s∶2 s。超声处理后，4 000 r/min离心10 min，收集滤液，将滤渣继续加80 mL去离子水提取1次，合并滤液，在50 ℃下旋转蒸发浓缩至30 mL，加入3倍体积的95%乙醇，搅拌以沉淀多糖，4 ℃过夜。离心收集沉淀，依次用95%乙醇、无水乙醇、丙酮、乙醚清洗。室温挥干溶剂后，沉淀用50 mL水溶解，得到多糖溶液。

1.2.3 黄酮和多糖含量的测定 黄酮含量的测定以芦丁为标准，采用亚硝酸钠-硝酸铝-氢氧化钠显色法[8]；多糖含量的测定采用苯酚-硫酸法，以葡萄糖为标准[9]。计算公式如下：

得率=多糖或黄酮质量/原料的质量×100%

1.2.4 总还原力的测定 1 mL样品稀释液中加入2.5 mL pH 6.6磷酸盐缓冲液、1.0%铁氰化钾2.5 mL，混合均匀后于50 ℃恒温20 min，再加入2.5 mL 10.0%三氯乙酸，然后3 000 r/min离心10 min，取上层清液2.5 mL，加去离子水2.5 mL和0.1% FeCl3 0.5 mL，在波长700 nm处测定吸光度[10]。

1.2.5 羟自由基（·OH）清除率的测定[11] 取2 mL样品稀释液依次加入2 mL 3 mmol/L FeSO4、2 mL 3 mmol/L的H2O2，混匀后25 ℃反应10 min，再加入2 mL 6 mmol/L水杨酸，混匀静置15 min，在波长510 nm处测定其吸光度值记为Ai；用去离子水代替水杨酸时的吸光度值记为Aj；以蒸馏水代替稀释液的吸光度值记为A0。计算公式如下：

·OH清除率=[1-（Ai-Aj）/A0]×100%

1.2.6 DPPH·清除率的测定[11] 取3 mL样品稀释液，加入1 mL 0.05 mg/mL的DPPH·溶液，25 ℃反应20 min，3 500 r/min离心10 min，取上清液在波长517 nm处测定其吸光度值为Ai；另取3 mL稀释液于试管中，加入无水乙醇1 mL，反应20 min，3 500 r/min离心10 min，取上清液在波长517 nm处测定其吸光度值为Aj；以1 mL DPPH·溶液和3 mL无水乙醇相同条件下反应，其吸光度值记为A0。

DPPH·清除率=[1-（Ai- Aj）/A0]×100%

2 结果与分析

2.1 超声时间对和田枣中黄酮和多糖得率的影响

超声提取不同时间对和田枣中黄酮和多糖得率的影响如图1。由图1可知，和田枣中黄酮得率在超声20、30、40 min时基本相近，其得率分别为0.73%、0.76%和0.78%，考虑到超声能量的消耗，选择超声处理20 min提取黄酮为宜。和田枣中多糖得率在超声处理30 min时达到最大，为2.32%，随着超声时间进一步延长，多糖得率开始下降。可能是因为长时间的超声导致多糖大分子被降解成小分子，在乙醇沉淀时小分子量多糖不易沉淀，导致最终的多糖得率下降[12]。因此，选择超声处理30 min提取多糖为宜。

2.2 超声功率对和田枣中黄酮和多糖得率的影响

由图2可知，当超声功率达到600 W时，和田枣中黄酮得率达到最大为0.88%，继续增加超声功率，黄酮得率基本不变。同超声时间对和田枣中多糖得率的影响相似，过高的超声功率也会引起和田枣中多糖的降解，从而使得多糖的得率降低。在超声功率为400 W时，和田枣中多糖得率最大，为2.32%。因此，选择超声功率为600 W提取和田枣中黄酮，选择超声功率400 W提取多糖为宜。

2.3 和田枣中黄酮和多糖的总还原力

Yen等[13]的研究表明，抗氧化剂的抗氧化性越强，则其还原力也越强，且其吸光度值越高，这种反应混合物的还原性越强。由图3可知，和田枣中黄酮和多糖的吸光度值与各物质的浓度之间均呈正比关系，说明其总还原力随着各物质浓度的增加而增强，和田枣中的这两种成分均为有效的抗氧化剂。

2.4 和田枣中黄酮和多糖对·OH清除率的影响

羟自由基清除率是反映药物或保健品抗氧化作用的重要指标，它能与生物体内的多种分子作用，造成氨基酸、糖类、核酸和脂类等物质的氧化性损伤，使细胞坏死或突变。由图4可知，当黄酮浓度为0.22 mg/mL时，其对·OH的清除率为53.5%；当多糖的浓度为4 mg/mL时，其对·OH的清除率为61.1%；两者对·OH的清除率与浓度均呈剂量效应关系，说明和田枣中的黄酮和多糖都是较好的·OH自由基的清除剂。endprint

2.5 和田枣中黄酮和多糖对DPPH·的清除率

DPPH·是一种稳定的以氮为中心的自由基，若试验材料能清除它，则表示该材料具有降低羟自由基、烷自由基或过氧自由基浓度和打断脂质过氧化链反应的作用。和田枣黄酮和多糖对DPPH·清除率的结果如图5所示。由图5可知，黄酮在较低的浓度时具有对DPPH·较强的清除率，其IC50仅为0.015 mg/mL；多糖对DPPH·清除率的IC50为0.16 mg/mL，所以二者均具有较强的清除DPPH·的作用。

3 结论

黄酮和多糖类化合物在抗肿瘤、抗炎、降血糖、抗衰老和抗氧化等方面发挥着重要的生物活性作用。从食材中提取到的生物活性成分由于没有毒副作用、价格低、资源丰富等优点，已成为当今世界新药的发展方向之一。由于生物体内产生的自由基可直接损伤各种生物膜，导致多种疾病的发生，所以自由基的清除率是反映抗氧化作用大小的重要指标。本研究运用超声技术从和田枣中提取黄酮和多糖，在较短的处理时间获取了较高的产物得率。通过分析测定发现，得到的黄酮和多糖均具有较强的总还原力，对·OH和DPPH·具有较好的清除作用。为了开发出更多具有抗氧化和抗衰老的功能性食品，有关黄酮和多糖的结构与抗氧化性之间的关系、体内活性差异等有待于进一步研究。

参考文献：

[1] 朱 丹，袁 芳，孟 坤，等.黄酮类化合物的研究进展[J].中华中医药杂志，2007，22（6）：387-389.

[2] 施松善，王顺春.多糖的生物活性研究进展[J].生命科学，2011， 23（7）： 662-670.

[3] 曲泽洲，王永蕙.中国枣树志·枣卷[M].北京：中国林业出版社，1993.

[4] SUSLICK K S，EDDINGSAAS N C，FLANNIGAN D J，et al. Extreme conditions during multibubble cavitation： Sonoluminescence as a spectroscopic probe[J]. Ultrasonics Sonochemistry， 2011，18（4）：842-846.

[5] GABRIEL A A. Microbial inactivation in cloudy apple juice by multi-frequency Dynashock power ultrasound[J].Ultrasonics Sonochemistry，2012，19（2）：346-351.

[6] 何竞旻，王瑞侠，黄劲松.超声波在药用植物提取中的应用研究[J].池州学院学报，2009，23（3）：67-69.

[7] SIVAKUMAR V，ANNA J L，VIJAYEESWARRI J，et al.Ultrasound assisted enhancement in natural dye extraction from beetroot for industrial applications and natural dyeing of leather[J].Ultrasonics Sonochemistry，2009，16（6）：782-789.

[8] 叶 春，阚建全，谭书明.鱼腥草叶总黄酮的提取分离[J].农业工程学报， 2008，24（10）：227-232.

[9] 赵亚华.生物化学实验技术教程[M].华南理工大学出版社， 2000.

[10] ZHU K X，SU C Y，GUO X N，et al. Influence of ultrasound during wheat gluten hydrolysis on the antioxidant activities of the resulting hydrolysate[J]. International Journal of Food Science and Technology，2011，46（5）：1053-1059.

[11] WANG D，ZHAO Y，JIAO Y，et al.Antioxidative and hepatoprotective effects of the polysaccharides from Zizyphus jujube cv. Shaanbeitanzao[J].Carbohydrate Polymers，2012，88（4）：1453-1459.

[12] 刘娜女，张 静，孙润广，等.超声对鸡腿菇多糖结构及生物活性的影响[J].化学学报，2011，69（15）：1824-1832.

[13] YEN G C，DUH P D，TSAI C L. Relationship between antioxidant activity and maturity of peanut hulls[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry，1993， 41： 67-70.endprint

2.5 和田枣中黄酮和多糖对DPPH·的清除率

DPPH·是一种稳定的以氮为中心的自由基，若试验材料能清除它，则表示该材料具有降低羟自由基、烷自由基或过氧自由基浓度和打断脂质过氧化链反应的作用。和田枣黄酮和多糖对DPPH·清除率的结果如图5所示。由图5可知，黄酮在较低的浓度时具有对DPPH·较强的清除率，其IC50仅为0.015 mg/mL；多糖对DPPH·清除率的IC50为0.16 mg/mL，所以二者均具有较强的清除DPPH·的作用。

3 结论

黄酮和多糖类化合物在抗肿瘤、抗炎、降血糖、抗衰老和抗氧化等方面发挥着重要的生物活性作用。从食材中提取到的生物活性成分由于没有毒副作用、价格低、资源丰富等优点，已成为当今世界新药的发展方向之一。由于生物体内产生的自由基可直接损伤各种生物膜，导致多种疾病的发生，所以自由基的清除率是反映抗氧化作用大小的重要指标。本研究运用超声技术从和田枣中提取黄酮和多糖，在较短的处理时间获取了较高的产物得率。通过分析测定发现，得到的黄酮和多糖均具有较强的总还原力，对·OH和DPPH·具有较好的清除作用。为了开发出更多具有抗氧化和抗衰老的功能性食品，有关黄酮和多糖的结构与抗氧化性之间的关系、体内活性差异等有待于进一步研究。

参考文献：

[1] 朱 丹，袁 芳，孟 坤，等.黄酮类化合物的研究进展[J].中华中医药杂志，2007，22（6）：387-389.

[2] 施松善，王顺春.多糖的生物活性研究进展[J].生命科学，2011， 23（7）： 662-670.

[3] 曲泽洲，王永蕙.中国枣树志·枣卷[M].北京：中国林业出版社，1993.

[4] SUSLICK K S，EDDINGSAAS N C，FLANNIGAN D J，et al. Extreme conditions during multibubble cavitation： Sonoluminescence as a spectroscopic probe[J]. Ultrasonics Sonochemistry， 2011，18（4）：842-846.

[5] GABRIEL A A. Microbial inactivation in cloudy apple juice by multi-frequency Dynashock power ultrasound[J].Ultrasonics Sonochemistry，2012，19（2）：346-351.

[6] 何竞旻，王瑞侠，黄劲松.超声波在药用植物提取中的应用研究[J].池州学院学报，2009，23（3）：67-69.

[7] SIVAKUMAR V，ANNA J L，VIJAYEESWARRI J，et al.Ultrasound assisted enhancement in natural dye extraction from beetroot for industrial applications and natural dyeing of leather[J].Ultrasonics Sonochemistry，2009，16（6）：782-789.

[8] 叶 春，阚建全，谭书明.鱼腥草叶总黄酮的提取分离[J].农业工程学报， 2008，24（10）：227-232.

[9] 赵亚华.生物化学实验技术教程[M].华南理工大学出版社， 2000.

[10] ZHU K X，SU C Y，GUO X N，et al. Influence of ultrasound during wheat gluten hydrolysis on the antioxidant activities of the resulting hydrolysate[J]. International Journal of Food Science and Technology，2011，46（5）：1053-1059.

[11] WANG D，ZHAO Y，JIAO Y，et al.Antioxidative and hepatoprotective effects of the polysaccharides from Zizyphus jujube cv. Shaanbeitanzao[J].Carbohydrate Polymers，2012，88（4）：1453-1459.

[12] 刘娜女，张 静，孙润广，等.超声对鸡腿菇多糖结构及生物活性的影响[J].化学学报，2011，69（15）：1824-1832.

[13] YEN G C，DUH P D，TSAI C L. Relationship between antioxidant activity and maturity of peanut hulls[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry，1993， 41： 67-70.endprint

2.5 和田枣中黄酮和多糖对DPPH·的清除率

DPPH·是一种稳定的以氮为中心的自由基，若试验材料能清除它，则表示该材料具有降低羟自由基、烷自由基或过氧自由基浓度和打断脂质过氧化链反应的作用。和田枣黄酮和多糖对DPPH·清除率的结果如图5所示。由图5可知，黄酮在较低的浓度时具有对DPPH·较强的清除率，其IC50仅为0.015 mg/mL；多糖对DPPH·清除率的IC50为0.16 mg/mL，所以二者均具有较强的清除DPPH·的作用。

3 结论

黄酮和多糖类化合物在抗肿瘤、抗炎、降血糖、抗衰老和抗氧化等方面发挥着重要的生物活性作用。从食材中提取到的生物活性成分由于没有毒副作用、价格低、资源丰富等优点，已成为当今世界新药的发展方向之一。由于生物体内产生的自由基可直接损伤各种生物膜，导致多种疾病的发生，所以自由基的清除率是反映抗氧化作用大小的重要指标。本研究运用超声技术从和田枣中提取黄酮和多糖，在较短的处理时间获取了较高的产物得率。通过分析测定发现，得到的黄酮和多糖均具有较强的总还原力，对·OH和DPPH·具有较好的清除作用。为了开发出更多具有抗氧化和抗衰老的功能性食品，有关黄酮和多糖的结构与抗氧化性之间的关系、体内活性差异等有待于进一步研究。

参考文献：

[1] 朱 丹，袁 芳，孟 坤，等.黄酮类化合物的研究进展[J].中华中医药杂志，2007，22（6）：387-389.

[2] 施松善，王顺春.多糖的生物活性研究进展[J].生命科学，2011， 23（7）： 662-670.

[3] 曲泽洲，王永蕙.中国枣树志·枣卷[M].北京：中国林业出版社，1993.

[4] SUSLICK K S，EDDINGSAAS N C，FLANNIGAN D J，et al. Extreme conditions during multibubble cavitation： Sonoluminescence as a spectroscopic probe[J]. Ultrasonics Sonochemistry， 2011，18（4）：842-846.

[5] GABRIEL A A. Microbial inactivation in cloudy apple juice by multi-frequency Dynashock power ultrasound[J].Ultrasonics Sonochemistry，2012，19（2）：346-351.

[6] 何竞旻，王瑞侠，黄劲松.超声波在药用植物提取中的应用研究[J].池州学院学报，2009，23（3）：67-69.

[7] SIVAKUMAR V，ANNA J L，VIJAYEESWARRI J，et al.Ultrasound assisted enhancement in natural dye extraction from beetroot for industrial applications and natural dyeing of leather[J].Ultrasonics Sonochemistry，2009，16（6）：782-789.

[8] 叶 春，阚建全，谭书明.鱼腥草叶总黄酮的提取分离[J].农业工程学报， 2008，24（10）：227-232.

[9] 赵亚华.生物化学实验技术教程[M].华南理工大学出版社， 2000.

[10] ZHU K X，SU C Y，GUO X N，et al. Influence of ultrasound during wheat gluten hydrolysis on the antioxidant activities of the resulting hydrolysate[J]. International Journal of Food Science and Technology，2011，46（5）：1053-1059.

[11] WANG D，ZHAO Y，JIAO Y，et al.Antioxidative and hepatoprotective effects of the polysaccharides from Zizyphus jujube cv. Shaanbeitanzao[J].Carbohydrate Polymers，2012，88（4）：1453-1459.

[12] 刘娜女，张 静，孙润广，等.超声对鸡腿菇多糖结构及生物活性的影响[J].化学学报，2011，69（15）：1824-1832.

[13] YEN G C，DUH P D，TSAI C L. Relationship between antioxidant activity and maturity of peanut hulls[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry，1993， 41： 67-70.endprint