苦荞水提液清除活性氧作用研究

张以忠+邓琳琼

摘要：用NBT光化还原法、Fenton反应法和钼酸铵显色分光光度法对苦荞[Fagopyrum tataricum（L.） Gaertn]叶和茎水提液清除羟基自由基（·OH）、超氧阴离子自由基（·O2-）和过氧化氢（H2O2）的作用进行了研究。结果表明，苦荞叶和茎水提液具有较强的清除自由基能力，而且随水提液浓度增加其清除能力增强。其中叶的清除能力显著高于茎。

关键词：苦荞[Fagopyrum tataricum（L.） Gaertn]；水提液；自由基；清除能力

中图分类号：R285.5；S517 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2014）15-3597-04

Scavenging Reactive Oxygen Species by the Aqueous Extraction of

Fagopyrum tataricum（L.） Gaertn

ZHANG Yi-zhong， DENG Lin-qiong

（School of Geography and Life Science， Bijie University， Bijie 551700， Guizhou，China）

Abstract： The scavenging effects of aqueous extractions from the leaf and the aerial stem of Fagopyrum tartaricum on hydroxyl radicals， superoxide anion radicals and hydrogen peroxide were studied with nitro blue terra-zolium photochemica reduction， Fenton reaction and spectrophotometric assay. The results showed that the aqueous extractions from the leaf and aerial stem of Fagopyrum tartaricum had a strong capacity of scavenging radicals. The scavenging capacity was enhanced with the increase of concentration of the aqueous extractions. The scavenging capacity of the aqueous extractions from leaf was significantly higher than that of those from aerial stem.

Key words： Fagopyrum tataricum（L.）Gaertn； aqueous extraction； radicals； scavenging capacity

收稿日期：2013-11-14

基金项目：贵州省教育厅自然科学研究项目（黔教科2010074号）；中央高校基本科研业务费专项资金资助项目（XDJK2012C111）；贵州省科技厅、

毕节市科技局及毕节学院科技联合基金项目[黔科合J字LKB（2013）21号]

作者简介：张以忠（1977-），男，贵州毕节人，副教授，硕士，主要从事植物遗传育种、生物化学及分子生物学研究，（电话）13985887356（电子信箱）

z8300300@126.com。

活性氧（reactive oxygen species，ROS）是指生物体内有氧代谢过程中产生或在外界物理化学因素诱导下产生含有氧原子且氧化能力很强的多种物质的总称[1，2]。主要有超氧阴离子自由基（·O2–）、羟基自由基（·OH）、过氧化氢（H2O2）等。自由基具有高度的化学活性，在生命活动的代谢过程中不断产生，与生物体衰老及许多疾病的发生都有重要关系[3-7]。正常情况下，活性氧的产生和清除处于平衡状态，但受到生物或非生物胁迫时，会产生过量的活性氧[8]。高浓度的活性氧可通过脂质过氧化反应等途径损伤组织细胞，导致细胞死亡、染色体突变和畸变及其机体的癌变[9，10]。因此，抑制脂质过氧化或增强机体抗氧化功能对防御疾病有着重要意义[11]。研究发现，人体长期摄入一定量的抗氧化物质能有效地降低心脑血管疾病和癌症发病率[12，13]。但一些人工化学合成的抗氧化剂具有一定的毒副作用，因此，从食物中寻找天然的抗氧化剂具有重要意义。

苦荞[Fagopyrum. tataricum（L.）Gaertn]属蓼科（Polygnaceae）荞麦属（Fagopyrum Mill）两个栽培种之一，为一年生草本植物，其营养价值居粮食作物之首。不仅营养成分丰富，营养价值高，而且具有较高的药用价值，属药食两用作物。具有降糖脂、降胆固醇、消炎等功效，被营养学家们称为21世纪具有前途的绿色食品[14，15]。近年来，随着人们生活水平的不断提高，对保健食品越来越重视，而苦荞独特的保健功能倍受人们的关注，但对其抗氧化活性的研究报道较少，且仅集中在某一器官上。而植物的不同器官对活性氧的清除作用有所不同[16]。鉴于此，本研究探讨了苦荞叶和茎水提液对羟基自由基（·OH）、超氧阴离子自由基（·O2-）和过氧化氢（H2O2）的清除作用，以期为荞麦遗传育种、开发及利用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 供试材料

供试材料为贵州毕节苦荞（编号：TA2011100800

1），来源于毕节学院地理与生命科学学院荞麦种子资源库。endprint

1.2 方法

1.2.1 样品制备 苦荞种子从低温冰柜中取出，于2012年3月将其播种于贵州省毕节市七星关区鸭池镇试验田。盛花期时分别取其茎和叶，蒸馏水洗净，40 ℃下恒温烘干至恒重，将其打粉，各取3 g粉末，分别按1∶45（g/mL，下同）和1∶40加蒸馏水，80 ℃下恒温振荡（140 r/min）1 h，过滤收集滤液，残渣分别再按1∶25加蒸馏水，80 ℃恒温振荡（140 r/min）1 h，过滤收集滤液，合并两次滤液即为苦荞茎和叶水提取液（茎和叶水提液浓度分别为70.0、75.4 mg/mL），将其储存冰箱备用。

1.2.2 提取液对·OH、·O2-和H2O2的清除率测定

1）提取液对·OH的清除率测定。参照文献[16]的方法，稍加改动。苦荞每种器官（茎、叶）均设5个浓度梯度（0.644、1.288、1.932、2.576、3.220 mg/mL），分别测定茎和叶在各浓度下对·OH的清除率。反应体系总体积为3.0 mL，包含pH7.4的PBS 0.75 mL、2 mmol/L的EDTANa2-Fe（Ⅱ）1.0 mL，70 μg/mL的番红花红T 0.5 mL，不同浓度供试液0.25 mL和0.33%的H2O2溶液0.5 mL。将其充分混匀，置37 ℃恒温水浴锅中保温30 min后，用723 N型分光光度计于520 nm处测其吸光度。加不同浓度供试液的体系其吸光度为A样品，以提取介质（蒸馏水）代替供试液的体系其吸光度为A空白，两者均以未加EDTANa2-Fe（Ⅱ）（用蒸馏水代替）作对照，各自与其对照吸光度之差分别记为△A样品和△A空白。供试液对·OH的清除能力以清除率表示，清除率=（△A空白-△A样品）/△A空白×100%。

2）提取液对·O2-的清除率测定。参照文献[16]的方法，稍加改动。苦荞每种器官（茎、叶）均设5个浓度梯度（0.256、0.512、0.768、1.024 和1.280 mg/mL），分别测定茎和叶在各浓度下对·O2-的清除率。反应体系总体积为3.25 mL，包含不同浓度提取液0.25 mL，14.5 mmol/L的 L-Met 2.7 mL，3.0 mmol/L的EDTA 0.1 mL，2.25 mmol/L的 NBT 0.1mL，60 μmol/L核黄素0.1 mL（EDTA、NBT、核黄素均以50 mmol/L pH 7.8的PBS配制）。混匀倒入吸光度一致的比色皿，在3 000 lx下光照10 min，反应后立即避光，迅速颠倒混匀，立即在560 nm下测其吸光度。加不同浓度供试液的体系其吸光度为A样品，以提取介质（蒸馏水）代替供试液的体系其吸光度为A对照，均以PBS代替NBT作空白。样品管和对照管吸光度与各自空白之差分别记为△A样品和△A对照。供试液对·O2-的清除能力以清除率表示，清除率=（△A对照-△A样品）/△A对照×100%。

3）提取液对H2O2的清除率测定。参照文献[17]的方法，稍加改动。具体方法如下：苦荞每种器官（茎、叶）均设5个浓度梯度（0.704、1.408、2.112、2.816和3.520 mg/mL），分别测定茎和叶在各浓度下对H2O2的清除率。反应体系总体积为3.25 mL，其反应过程为：在样品管中加入0.25 mL不同浓度的样品，然后放入37 ℃水浴锅，迅速加入1.5 mL基质液[60 mmol/L的PBS（pH 7.4）含65 μmol/L的H2O2]作为样品组，保温1.5 min后立即加入32.4 mmol/L钼酸铵溶液1.5 mL，自来水中终止反应5 min，405 nm处测其吸光度。以提取介质（蒸馏水）代替供试液作对照，均以PBS代替基质液作空白，样品管和对照管吸光度与各自空白吸光度之差分别记为△A样品和△A对照。供试液对H2O2的清除能力以清除率表示。清除率=（△A对照-△A样品）/△A对照×100%。

1.2.3 数据处理 采用Excel 2003计算清除率、绘制折线图，SPSS11.5统计软件进行显著性检验。

2 结果与分析

2.1 苦荞叶和茎水提液对·OH的清除作用

由图1可知，苦荞叶和茎水提液对·OH均具有清除作用，且随水提液浓度的增加，其清除率也不断升高。在水提液同一浓度下，叶的清除率均高于茎，表明苦荞叶水提液对·OH的清除作用高于茎。进一步对其作统计分析可知，叶水提液对·OH的平均清除率为76.99%，茎的为45.54%，苦荞叶水提液对·OH的清除作用显著（P<0.05）高于茎。

2.2 苦荞叶和茎水提液对·O2-的清除作用

由图2可知，苦荞叶和茎水提液对·O2-均具有清除作用，且随水提液浓度的增加，其清除率也不断升高。对其进行统计分析可知，叶水提液对·O2-的平均清除率为79.50%，茎的为57.37%，苦荞叶水提液对·O2-的清除作用显著（P<0.05）高于茎。

2.3 苦荞叶和茎水提液对H2O2的清除作用

由图3可知，苦荞叶、茎水提液对H2O2均具有一定的清除作用，但其清除率均较低，供试浓度下的最高清除率均小于50%。另外，其清除率随浓度的增加变化较小。对其进行统计分析可知，叶水提液对H2O2的平均清除率为16.42%，而茎的只有7.52%，苦荞叶水提液对H2O2的清除作用显著（P<0.05）高于茎。

3 小结与讨论

活性氧因具有高度的活泼性和极强的氧化能力，对人体危害很大，人体内羟基自由基（·OH） 、超氧阴离子自由基（·O2-）和过氧化氢（H2O2）等活性氧过量会使机体受到损伤，从而引起癌症、衰老、心血管疾病等[18，19]。正常情况下，机体可以清除一定量的自由基，使体内自由基的产生与清除处于平衡状态。但当自由基过多，造成机体紊乱时，必须寻找外源性自由基清除剂—抗氧化剂来清除机体内过多的自由基，这是减少癌症、衰老、心血管疾病等对人类健康威胁的有效手段之一[20]。然而，目前已发现，一些人工化学合成的抗氧化剂可能具有一定的毒副作用，服用此类抗氧化剂更可能会增加伤害机体的可能性。因此，从日常食物中寻找天然的抗氧化剂具有重要意义。endprint

苦荞属于自花且是闭花授粉的作物，种植适应性强，生育期短，产量较其他荞麦种高，含有黄酮、蛋白质、原花青素、膳食纤维等功效分子，尤其是芦丁的含量远远高于甜荞，具有降糖、抗缺血、抗菌、抗癌、助睡眠等保健功能，属于药食两用植物[15，21，22]，因此越来越受到人们的重视。目前有关苦荞抗氧化活性的研究报道较少，且均是集中在某一个器官上。姚亚平等[23]研究了苦荞和甜荞子粒乙醇提取物的抗氧化性发现，苦荞和甜荞乙醇提取物均有显著的抗氧化性，且呈剂量效应关系。曹艳萍[24]研究了苦荞叶提取物抗氧化性及其协同效应发现，苦荞叶提取物对羟自由基和超氧阴离子均有较强的清除能力，随着苦荞叶提取物量的增加其抗氧化作用增强。本研究首次对苦荞盛花期叶和茎水提液清除·OH、·O2-和H2O2进行了研究，结果发现叶和茎水提液对·OH、·O2-和H2O2均有清除作用，且随提取液浓度的增加其清除率也不断升高，与姚亚平等[23]及曹艳萍[24]的报道一致。另外，本研究还发现，虽然苦荞叶和茎水提液对·OH、·O2-和H2O2均有清除作用，但存在一定的差异。叶和茎水提液对·OH和·O2-清除作用均较强，且随提取液浓度升高其清除作用也不断增强，但两者对H2O2的清除作用均较弱，且受浓度影响较小。另外，苦荞叶水提液对·OH、·O2-和H2O2的清除作用均显著高于茎。因此本研究可为深入探讨苦荞叶和茎的抗氧化机理和合理开发利用苦荞资源提供一定参考。而苦荞在苗期、现蕾期和收获期叶和茎对·OH、·O2-和H2O2的清除作用是否与本研究结果一致还有待进一步研究。

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