全国海水浴场及经济贝类中腺病毒的分布

明红霞，樊景凤＊，梁玉波，关道明

（1.国家海洋局 国家海洋环境监测中心，辽宁 大连116023）

1 引言

海洋作为生活污水的重要蓄积地为胃肠道病毒（enteric viruses）提供了天然的栖息场所，随着沿海城市人口的增长，浴场海水和海产品的病毒污染已日益受到关注，因娱乐用水和贝类引发的病毒性急性胃肠炎报道在国内外屡见不鲜［1］，如1988年上海暴发的一起因食用毛蚶而造成的大范围甲肝病毒事件，造成了31万人感染［2］。

人类肠道腺病毒（Ad V40／Ad V41），属于腺病毒F亚属，是全球急性胃肠炎疾病中最流行的病原体之一，全年均可发生，且无季节差异［3］。由于腺病毒的核酸为双股DNA，因此，在自然水体中比RNA胃肠道病毒对紫外线的抵抗能力强［4］。正因如此，其阳性检出率和含量比其他胃肠道病毒要高一些，在有些环境样品中甚至比诺如病毒还高［5］，尤其是当常规细菌学指标低于管理标准时，该病毒仍然能被检测出来［6］。此外，腺病毒在环境样品中与甲肝病毒、戊肝病毒、人类特异性噬菌体Bactericidesf ragilityHSP40的污染均相关［7］。因此，美国环保局已经提出将其作为病毒污染的候选指示物，以此来执行常规的水质监测［8］，同时越来越多的研究证明，腺病毒也可以作为贝类体内病毒污染的指示物［9］。

由于腺病毒40和41在细胞培养过程中很难观测到噬斑，因此，细胞培养方法不适合于该病毒的检测［10］。分子生物学方法，如PCR技术以其特异性和敏感性等优势，在海水和贝类等环境样品人类胃肠道病毒的检测中得到广泛应用。本研究以全国主要海水浴场表层海水和沿海省市主要增养殖区经济贝类为研究对象，以腺病毒为胃肠道病毒指示物，选用实时定量PCR（real－time PCR）技术对其污染进行定量检测，旨在反映人类胃肠道病毒在这两种主要传播介质中的污染现状，同时为近岸海域生态管理提供科学依据。

2 材料与方法

2.1 样品的采集

于2007年8月游泳高峰期，选取全国重点沿海省市10个有代表性的海水浴场，从北至南依次是河北北戴河老虎石浴场（BDH）、大连金石滩浴场（JST）、山东烟台金石滩浴场（YT）、青岛第一海水浴场（QD）、江苏连云港连岛浴场（LYG）、浙江宁波松兰山浴场（NB）、福建厦门黄厝浴场（XM）、广东深圳大小梅沙浴场（SZ）、广西北海银滩浴场（BH）和海南三亚亚龙湾浴场（SY）（图1a），分别在距岸边100 m和1 000 m处采集10 L表层海水。

选取海水浴场布站的9个省份和天津市（无海水浴场）10个省市的主要海水贝类增养殖区，共布设45个站位，采集162份经济贝类样品，其中包括蚶类［毛蚶（Scapharcasubcrenata）、泥蚶（Arcagranosa）等］，蛤蜊类［中国蛤蜊（Mactrachinensis）、四角蛤蜊（Mactraquadrangularis）、青蛤（Cyclinasinensis）、菲律宾蛤仔（Ruditapesphilippinarum）等］，蛏类［缢蛏（Sinonovaculaconstricta）、长竹蛏（Solenstrictus）等］，牡蛎类［近江牡蛎（Cr assostrearivul aris）、缘齿牡蛎（Dendostreacrenulif era）、太 平 洋 牡 蛎 （Crassostrea gigas）等］，贻贝类［翡翠贻贝（Per naviridis）、紫贻贝（Mytilusedulis）］和扇贝类［栉孔扇贝（ChlamysFarreri）、虾夷盘扇贝（Patinopectenyessoensis）、海湾扇贝（Ar gopectenirradians）等］。冷藏空运回实验室，冻存备检，站位布设如图1b所示。

2.2 病毒的回收

由于海水和贝类样品中的病毒含量比较低，所以在进行定量检测之前必须先对其进行浓缩回收。

图1 我国重点海水浴场（a）及贝类增养殖区（b）调查站位

水样中病毒的回收采用超滤法：10 L海水先经滤纸过滤除杂质，再分别经孔径为0.8μm和0.2μm的滤膜过滤，用Millipore装置（Millipore Pellicon Mini TFF，截留相对分子质量为100×103）将10 L海水浓缩到100 mL左右后用Centricon Plus－70超滤管将水样浓缩到350μL左右，冻存备检［11］。

贝类样品中病毒的回收方法：首先用匀浆器把贝类组织搅碎，取20 g加入等体积的甘氨酸缓冲液（p H 9.0），调整p H至7.2，震荡30 min；于4℃5 000 g离心15 min，取上清；4℃10 000 g离心1 h，取上清；4℃140 000 g超速离心1.5 h，取沉淀，用1 mL的磷酸盐缓冲液（PBS）（p H 7.4）重悬，以沉淀溶解为宜。为去除贝类组织中蛋白质对后续反应的影响，向悬液中加入等体积氯仿，震荡15 min，然后4 000 g离心30 min，收集上层液相即为病毒抽提样，约500μL。

2.3 Taq Man探针法real－time PCR技术检测贝类样品中的腺病毒

2.3.1 核酸提取

用Viral Nucleic Acid Extraction KitⅡ（Gene Aid）进行水样和贝类样品中病毒DNA的提取，操作程序按照说明书进行，最后溶解于50μL DNA－free水中，待检。

2.3.2 引物设计

以腺病毒Ad V40为标准病毒株，根据其六邻体（hexon，形成病毒衣壳20个体面的主要蛋白）设计外引物Ad1和Ad2［11］，构建质粒，同样根据六邻体区设计内引物 AD3和 AD4，探针 ADP［12］，建立real－time PCR方法。引物和探针由宝生物工程（大连）有限公司合成，具体信息如表1所示。

表1 腺病毒real－time PCR的引物和探针信息

2.3.3 腺病毒质粒的构建

以Ad V40为标准品构建质粒：首先采用外引物Ad1和Ad2进行PCR扩增，切下琼脂糖凝胶中的目的条带，用凝胶回收试剂盒进行纯化，得到482 bp的DNA片段。然后用p MD○R 19－T载体将纯化后的片段连接到大肠杆菌DH5α感受态细胞上，经转化和蓝白斑筛选后，用载体引物（RV－M和 M13－47）扩增验证目的片段，采用高纯度质粒提取试剂盒（天根）提取质粒，测定吸光度值，计算重组质粒的拷贝数。

2.3.4 Taq Man探针法real－time PCR标准曲线的建立

用EASY－Dillution将已知拷贝数的重组质粒作10倍系列梯度稀释，将标准DNA稀释至终浓度为107～100copies／μL，建立探针法real－time PCR。根据每个反应管内荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数（Ct值）最小而荧光增加值（ΔRn）较大的原则，确定最佳引物浓度为0.2μmol／L，探针浓度为0.15 μmol／L。反应体系为20μL：PremixExTaqTM（2×）10.0μL；PCR上游引物AD3（10μmol／L）0.4μL；下游引物 AD4（10μmol／L）0.4μL；荧光探针 ADP（3 μmol／L）1.0μL；ROX Reference DyeⅡ（50×）0.4μL；DNA模板1.0μL；dd H2O（灭菌双蒸水）6.8μL，每个样品设置两个平行。优化后的反应程序采用三步法：95℃10 s；58℃15 s；62℃1 min，40 cycles。利用实时定量PCR仪（7500 ABI公司）SDS软件获得标准曲线及其相应数据。

2.3.5 Real－time PCR灵敏度、特异性和重复性测试

为检测Taq Man探针法real－time PCR方法的灵敏度，将质粒逐级稀释，检测其灵敏度。

为检测Taq Man探针法real－time PCR引物和探针的特异性，在操作过程中用上述引物和探针同时进行脊髓灰质炎病毒Ⅰ型疫苗株、甲肝病毒疫苗株、轮状病毒和星状病毒的c DNA扩增，用磷酸盐缓冲液（PBS）作为阴性对照。

为检测Taq Man探针法real－time PCR的重复性，分两次重复检测同一浓度的标准品106copies／μL，即每次实验均用此标准品作为模板，各设6个平行，比较两次结果Ct值的标准差。

2.3.6 样品中腺病毒的定量测定

通过预实验测定样品的浓度范围，从而确定标准品的稀释范围。取海水和贝类样品的DNA为模板，采用已建立的探针法real－time PCR定量检测20份表层海水和162份贝类样品中的腺病毒。每个样品设置两个重复，实验同时设置阴性对照，扩增标准曲线。

2.4 数据统计

应用Fisher exact test软件，分析腺病毒的污染在离岸100 m和1 000 m处是否有差别，取95%的置信区间。

3 结果

3.1 Taq Man探针法real－time PCR标准曲线的制备

以起始模板数（CO）的对数为X轴，以临界循环数为Y轴，建立实时定量PCR标准曲线。经扩增，当DNA重组质粒在5.187×106～5.187×102copies／μL范围内时曲线的相关性最好，相关系数（R2）＝0.996 3，斜率为－3.028（有效范围－3.0～－3.5），阴性对照无扩增，符合样品测定的要求（图2）。

3.2 Real－time PCR方法的灵敏度、特异性和重复性试验

经测定，本研究建立的real－time PCR方法至少能检测到51 copies病毒。

以脊髓灰质炎病毒、甲肝病毒、轮状病毒和星状病毒4种常见胃肠道感染病毒的c DNA为模板，检测real－time PCR方法的特异性，结果均无信号扩增，说明引物和探针特异性良好，后续由该方法测定的腺病毒结果可靠。

Real－time PCR方法的重复性测试结果如表2所示，两组重复实验测得5.187×106copies／μL标准品的Ct值标准差分别为0.087和0.082，说明本研究建立的real－time PCR方法重复性良好。

3.3 样品中腺病毒的检测

经超滤法浓缩后，采用优化的real－time PCR方法检测全国10个海水浴场表层海水，结果有5个浴场受到了腺病毒污染，20份水样中有7份样品呈腺病毒阳性，阳性检出率为35%，其浓度范围为1.1×107～2.8×107copies／L，具体含量如表3所示。应用Fisher exact test软件分析腺病毒的污染与离岸距离的远近（100 m和1 000 m）之间相关性，结果二者差异不显著（表4）。

表3 中国近岸20份海水样品的Taq Man real－time PCR检测结果

应用优化的real－time PCR方法对162份贝类样品中腺病毒进行分析，结果得到19份阳性样品，其阳性检出率为11.7%，贝类组织中腺病毒含量为2.4×104～3.1×105copies／g，与Costafreda等［13］检测的蛤蜊体内甲肝病毒含量（103～105copies／g）相近。全国10个重点沿岸省市除河北省和天津市外，其余8个省份主要增养殖区的经济贝类均被腺病毒污染。在选取的6种经济贝类样品中，除蚶类外其余5种均被腺病毒污染，其中牡蛎的阳性检出率最高（为29.4%），其次是蛏类（为15.8%）（表5）。

表4 离岸100 m和1 000 m距离处海水中腺病毒阳性之间的相关性分析

表5 全国10个沿海省市162份贝类的腺病毒定量检测结果

4 讨论

环境中的肠道腺病毒主要通过粪－口途径进入人体，在海水浴场娱乐（如游泳、划船等）时接触了受腺病毒沾污的海水，生食或食用烹调不当的染病毒的海产品，都有可能造成胃肠炎疾病的感染［14］。虽然腺病毒已经在环境样本中被普遍检测到［15—16］，但是在我国海水浴场和贝类样品中的相关报道并不多见。前期，我们在主要游泳季节（5—10月），采用普通PCR技术分析结果表明，大连星海浴场表层海水中四种胃肠道病毒污染比较普遍，且8月份游泳高峰期最为严重，以腺病毒污染为首［17］。用同样的方法检测了8月份我国主要增养殖区经济贝类，结果显示腺病毒的污染也比较普遍［18］。为全面掌握腺病毒的污染程度，本研究在前期定性检测的基础上对腺病毒进行了定量检测。

全国10个海水浴场20份水样中腺病毒的含量为1.1×107～2.8×107copies／L，高于Fong等［18］检测到的美国某浴场和污水处理厂中腺病毒污染浓度（5.35×105和1.15×106copies／L）。由此可见，目前污水处理方法不足以去除其中的病毒粒子。通过比较娱乐者较密集的离岸100 m处和较稀疏的离岸1 000 m处腺病毒的分布与含量发现，虽然前者阳性检出率比后者高（表3），但是二者无显著差别（见表4）。分析可能是由于潮汐、风浪等作用将病毒的污染范围进一步扩大，同时也反映了腺病毒在水环境中存活的时间较长，这一结果与指示细菌的分布有所不同［20］。

有关贝类体内甲肝病毒和诺如病毒的real－time PCR检测比较多［21—22］，但是腺病毒的相关报道却很少，目前仅见Engelska［23］对牡蛎和贻贝体内腺病毒35型污染情况进行分析。自贝类传播的微生物疾病被第一次报道以来，全世界因食用贝类而造成的胃肠炎疾病屡见不鲜［24］。在本次受检的162份贝类样品中，牡蛎的阳性检出率最高（表5），这一结果与国外临床调查结果一致［25］。美国每年有3 300万例食物传播疾病，其中8%由生食牡蛎引起，在因食用贝类而造成的胃肠炎疾病案例中牡蛎占了44%［26］。由此可见，牡蛎具有较强的携带病毒的能力。牡蛎是我国重要的海产贝类，除了能够富集甲肝、诺如病毒等病毒外，还能富集副溶血性弧菌等病原菌［27］，此外，还可能同时携带几种不同的病原体［28］，然而我国乃至世界沿海城市素有生食牡蛎的习惯，在本次调查中，牡蛎中腺病毒含量达2.4×104～1.1×105copies／g，由于目前的检测方法尚未标准化，导致目前国内外食品卫生安全中尚未对胃肠道病毒这一重要病原体作出安全阈值规定［29］，因此，为保障食品安全，消费者在食用双壳贝类时，一定要充分煮熟；同时建议管理者尽快将胃肠道病毒指标检测规范化并列入《海水贝类卫生标准》［28］。

在本次调查的10个沿海省市中，除天津市外其余省份的海水浴场或经济贝类均有不同程度的污染，尤其是山东、辽宁和浙江3个省份，其海水浴场和贝类增养殖区同时受到了腺病毒的污染，可见这3个省份近岸海水中粪便污染是一个比较普遍的现象。如果游泳者在被污染的海水浴场活动，或消费者食用被污染的贝类，都有可能造成感染。另有报道称，感染者及其携带者的粪便中病毒含量高达108～1010copies／g［30］，一旦感染者的粪便未经适当处理排入环境中，就有可能造成循环污染。

本研究采用real－time PCR方法，对我国主要海水浴场表层海水和海水增养殖区经济贝类中腺病毒的污染进行了定量检测，结果发现，腺病毒在这两个主要传播介质中存在普遍，且污染含量较高。人类肠道腺病毒可以很好地指示粪便污染，可以帮助公众预警病毒在人群中的暴发流行［31］。为管理部门制定娱乐用水以及贝类食品安全标准提供可靠的依据。

5 结论

（1）采用 Taq Man 探针法real－time PCR技术，分析全国10个海水浴场表层海水中肠道腺病毒的污染，其阳性检出率为35%，污染浓度为1.1×107～2.8×107copies／L；离岸100 m处和1 000 m处腺病毒的污染分布及浓度没有显著差异。

（2）采用 Taq Man 探针法real－time PCR技术，分析全国10个省市162份经济贝类中腺病毒的阳性检出率为11.7%，污染浓度为2.4×104～3.1×105copies／g，10个省市中有8个省市检出肠道腺病毒，6种经济贝类中，牡蛎富集病毒的能力最强。

（3）在调查的10个省市中，山东、辽宁和浙江3省的海水浴场和主要经济贝类均受到了腺病毒的污染，说明这3个省份近岸粪便的污染普遍。人类肠道腺病毒可以很好地指示粪便污染，帮助公众预警病毒在人群中的暴发流行。

致谢：感谢中国疾病预防控制中心病毒病预防控制段招军研究员为本研究提供病毒阳性样本！

［1］Lop man B A，Reacher M H，Van Duijinhoven Y，et al.Viral gastroenteritis outbreaks in Europe，1995—2000［J］.Emerg Infect Dis，2003，9：90－96.

［2］Tang Y W，Wang J X，Xu Z Y，et al.A serologically confir med case－control study of a large outbreak of hepatitis A in China associated with consu mption of clams［J］.Epidemiol Infect，1991，107：651－658.

［3］Jurzik L，Hamza I A，Puchert W，et al.Chemical and microbiological parameters as possible indicators for hu man enteric viruses in surface water［J］.Int J Hyg Environ Heal，2010，213：210－216.

［4］Rigotto C，Hanley K，Rochelle P A，et al.Survival of adenovirus types 2 and 41 in surface and ground waters measured by a plaque assay［J］.Environ Sci Technol，2011，45：4145－4150.

［5］Hundesa A，Maluquer D E M，Albinana G C，et al.Develop ment of a qPCR assay for the quantification of porcine adenoviruses as an MST tool for swine fecal contamination in the environment［J］.J Virol Methods，2009，158：130－135.

［6］Silva H D，García－Zapata M T A，Anunciação C E.Why the Use of Adenovir uses as Water Quality Virologicmar ker？［J］.Food Environ Virol，2011，3：138－140.

［7］Cromeans T L，Kahler A M，Hill V R.Inactivation of adenoviruses，enteroviruses，and murine norovirus in water by free chlorine and monochloramine［J］.Appl Environ Microbiol.2010，76（4）：1028－1033.

［8］U.S.Environmental Protection Agency－USEPA.Drinking Water Contaminant Candidate List 3－Final［N］.Federal Register，2009，51856.Washington，DC.

［9］For miga cm，Allard A K，Conden－Hansson A C，et al.Evaluation of potential indicators of viral contamination in shellfish and their applicability to diverse geographical areas［J］.Appl Environ Microbiol，2003，69（3）：1556－1563.

［10］Jiang S C，Noble R，Chu W.Hu man adenovirus in water：Occurrence and health i mplication：A critical review［J］.Environ Sci Technol，2006，40（23）：7132－7140.

［11］He J W，Jiang S.Quantification of enterococci and human adenoviruses in environmental samples by real－time PCR［J］.Appl Environ Microbiol，2005，71：2250－2255.

［12］Haramoto E，Katayama H，Oguma K，et al.Application of cationcoated filtermethod to detection of noroviruses，enteroviruses，adenovirses，and Torque Teno vir uses in the Tamagawa River in Japan［J］.Appl Environ Microbiol，2005，71（5）：2403－2411.

［13］Costafreda M I，Bosch A，PintóR M.Develop ment，Evaluation，and Standardization of a real－time Taq Man Reverse Transcription－PCR Assay for Quantification of Hepatitis A Virus in Clinical and Shellfish Samples［J］.Appl Microbiol，2006，72（6）3846－3855.

［14］Aslan A，Xagoraraki I，Simmons F J，et al.Occurrence of adenovir us and other enteric viruses in limited－contact fresh water recreational areas and bathing waters［J］.J Appl Microbiol，2011，111（5）：1250－1261.

［15］Haramoto E，Katayama H，Oguma K，et al.Quantitative analysis of hu man enteric adenovir uses in aquatic environ ments［J］.J Appl Microbiol，2007，103（6）：2153－2159.

［16］Albinana G N，Clemente C P，Bofill M S，et al.Distribution of hu man polyomaviruses，adenovir uses，and hepatitis E virus in the environ ment and in a drinking－water treat ment plant［J］.Environ Sci Technol，2006，40（23）：7416－7422.

［17］明红霞，樊景凤，吴利军，等.四种人肠道病毒在大连金石滩浴场中的分布［J］.海洋环境科学，2008，27（6）：584－587.

［18］Ming H X，Fan J F，Wu L J，et al.Prevalance of human enteric viruses and a potential indicator of contamination in shellfish in China［J］.J Food Fafety，2013，33（2）：209－214.

［19］Fan J F，Ming H X，Wu L J，et al.Investigation of fecal colifor m and typical enteric virus in representative beaches of China［J］.Marine sciencebulletin，2011，13（2）：72－82.

［20］Jothikumar N，Cromeans T L，Sobsey M D，et al.Develop ment and evaluation of a broadly reactive Taq Man assay for rapid detection of hepatitis A virus［J］.Appl Environ Microbiol，2005，71：3359－3363.

［21］Kageyama T，Koji ma S，Shinohara M，et al.Broadly reactive and highly sensitive assay for Nor walk－like viruses based on real－time quantitative reverse transcription－PCR［J］.J Clin Microbiol，2003，41（4）：1548－1557.

［22］Hernroth B.The persistence of infectious adenovirus（type 35）in mussels（Mytilus edulis）and oysters（Ostrea edulis）［J］.Int J Food Microbiol，2007，113（3）：296－302.

［23］Richards G P.Shellfish－Associated Viral Disease Outbreaks［M］.Food Microbiology and Food Safety，2006：223－238.

［24］Costantini V，Loisy F，Lynn J，et al.Hu man and Ani mal Enteric Caliciviruses in Oysters from Different Coastal Regions of the United States［J］.Appl Environ Microbiol，2006，72（3）：1800－1809.

［26］Provost K，Dancho B A，Ozbay G，et al.Hemocytes are sites of enteric virus persistence within oysters［J］.Appl Environ Microbiol，2011，77（23）：8360－8369.

［26］Bur khardt W，Calci K R I.Selective accumulation may account for shellfish－associated viral illness［J］.Appl Environ Microbiol，2000，66：1375－1378.

［27］Le G F，Neill F H，Estes M K，et al.Detection and analysis of a small roundstructured virus strain in oyster simplicated in an outbreak of acute gastroenteritis［J］.Appl Environ Microbiol，1996b，62：4268－4272.

［28］GB 2744－1996，海水贝类卫生标准［S］.

［29］Logan C，O'leary J J，Sullivan O O.Real－time reverse transcription－PCR for detection of rotavirus and adenovirus as causative agents of acute viral gastroenteritis in children［J］.J Clin Microbiol，2006，44：3189－3195.

［30］Sedmak G，Bina D，Macdonald J.Assessment of an enterovirus sewage surveillance system by comparison of clinical isolates with sewage isolates from Mil waukee，Wisconsin，collected August 1994 to December 2002［J］.Appl Environ Microbiol，2003，69：7181－7187.

［31］Albinana G N，Miagostovich M P，Calqua B，et al.Analysis of adenoviruses and polyomaviruses quantified by qPCR as indicators of water quality in source and drinking－water treat ment plants［J］.Water Res，2009，43：2011－2019.