HPLC法测定双氢青蒿素哌喹片中的磷酸哌喹含量

郭毅新，张元杰，丁 涛，来国防

(1.云南省食品药品检验所，云南昆明650011;2.永城职业学院，河南永城476600)

双氢青蒿素哌喹片是双氢青蒿素与磷酸哌喹组成的复方剂型，本品种临床定位适用于各种类型疟疾，为目前国际上最有效的抗疟药之一。为保障用药安全，全面评价该药品质量，2012年度被列入国家评价性抽样品种。现行标准采用紫外－分光光度法测定其含量，由于紫外－分光光度法测定易受外界干扰，造成测定结果不准确。本文参考相关文献［1～5］，采用高效液相色谱方法，考察了不同填料色谱柱，不同流动相对磷酸哌喹的分离行为，并对优选出的高效液相色谱测定磷酸哌喹方法进行了方法学考察及样品的测定，结果该方法操作方便，色谱峰对称性好，测定结果重现性好，能有效控制本产品的质量。

1 仪器与试药

Waters 2695高效液相色谱仪(美国沃特世公司);AL204型电子天平(Mettler Toledo)。磷酸哌喹对照品(中国食品药品检定研究院，批号:10751－200501，纯度 91.2%)，乙腈为色谱纯，水为二次蒸馏水，三氯乙酸、磷酸为分析纯。双氢青蒿素哌喹片(规格:每片含双氢青蒿素40 mg，磷酸哌喹0.32 g，重庆市某制药公司提供)。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 色谱柱Watres Symmetry RP18(4.6 mm ×150 mm，5 μm);流动相:乙腈 －0.1% 三氯乙酸 － 磷酸(19∶81∶0.035)，检测波长:349 nm;柱温:30 ℃;流速:1.0 mL·min－1;进样量:20 μL。

图1 对照品图谱

图2 样品图谱中磷酸哌喹

2.2 供试品溶液的制备 取本品10片，研细，混匀，取8 mg，精密称定，置10 mL容量中，加流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，滤过，精密量取滤液3 mL置100 mL量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀，即得。

2.3 对照品溶液制备 精密称取磷酸哌喹对照品适量，加流动相制成每1 mL含磷酸哌喹15 μg的溶液，即得。

2.4 线性关系考察 精密称取磷酸哌喹对照品5.57 mg，至10 mL容量瓶中，加流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，精密量取3 mL至100 mL量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液，精密量取5、10、20、40、60 μL 注入液相色谱仪，进行测定，以峰面积的积分值为纵坐标，质量浓度为横坐标，绘制标准曲线，并以最小二乘法计算得回归方程:磷酸哌喹:Y=5.049 817×107X－1.839 466×104，在0.003 81～0.038 1 mg·mL－1(r=0.999 9)呈良好线性关系。

2.5 重复性试验 取双氢青蒿素哌喹片(批号:011011)供试品6份，照“2.2”项下方法制备供试品溶液，进样20 μL，供试品中磷酸哌喹的含量分别为:0.337、0.336、0.338、0.336、0.337、0.336 g/片。

2.6 稳定性试验 取供试品溶液于室温(20～25℃)下放置，分别于0、2、4、6、8 h 精密吸取 20 μL 进样，测定磷酸哌喹的峰面积，6针峰面积RSD为0.9%，结果显示供试品溶液在8 h内基本稳定。

2.7 回收率试验 取双氢青蒿素哌喹片细粉4 mg(批号:011011)9份，精密称定，分别按其质量分数的80%、100%、120%精密加入磷酸哌喹对照品适量，按“2.2”项下的方法制备供试品溶液，进行测定，计算加样回收率，结果见表1。

表1 回收率试验结果

2.8 样品测定 取本品3批，照“2.2”项下方法制备供试品溶液，进样20 μL，按上述色谱条件测定，以外标法(峰面积)计算样品中磷酸哌喹的含量，结果见表2。

表2 样品含量测定结果(n=2)

3 讨论

3.1 色谱柱的考察 考虑到磷酸哌喹为生物碱盐，极性较大，在一般色谱条件下，保留时间较短。参考相关文献选择氰基柱，以0.04 mol·L－1磷酸二氢钾溶液(稀盐酸调pH 2.5)－乙腈(90∶10)为流动相进行分离，结果色谱峰仍有一定的拖尾，随着磷酸哌喹浓度的增加，拖尾现象加重。

3.2 流动相考察 曾采用乙腈－磷酸二氢钾，甲醇－磷酸缓冲盐，甲醇－十二烷基磺酸钠，乙腈－水(11∶89，每 100 mL 水含三氟乙酸 50 μL，磷酸 40 μL，三乙胺 50 μL)，0.04 mol·L－1磷酸二氢钾 － 乙腈 －三乙胺(90∶10∶0.2，用磷酸调节 pH 至2.5)等溶液体系为流动相，但均因磷酸哌喹峰拖尾严重，无法准确定量。

3.3 经过反复试验，选择一般C18色谱柱，以乙腈－0.1%三氯乙酸 － 磷酸(19∶81∶0.035)为流动相，色谱峰保留时间合适，峰对称性好，可以准确定量。

［1］朱凯，范琦，张小松，等.HPLC测定双氢青蒿素哌喹片中磷酸哌喹的含量［J］.中国药学杂志，2008，43(9):713－714.

［2］李美琴，范琦，张晓松.HPLC同时测定复方双氢青蒿素片中磷酸哌喹与甲氧苄啶的含量［J］.华西药学杂志，2004，19(3):221 －223.

［3］张小松，江生，毛庆.磷酸哌喹有关物质的检测研究［J］.中国药事，2009，23(7):690 －691.

［4］国家药典委员会.中华人民共和国药典2010年版(二部)［S］.北京:中国医药科技出版社，2010.

［5］木书林，丁涛，来国防，等.项空气相色谱法测定双氢青蒿素哌喹片中乙醇残留含量［J］.药学研究，2013，32(9):504－506.