丝素蛋白／壳聚糖／纳米羟基磷灰石骨组织工程支架材料的体外细胞毒性评价＊

马立坤，叶 鹏，邓 江，黄文良，田仁元，吕雪峰

（遵义医学院第三附属医院骨科，贵州 遵义 563000）

理想的骨组织工程支架材料首先应具备良好的生物相容性，合适的孔径及生物降解性［1，2］。丝素蛋白（silk fibroin，SF）、壳聚糖（chitosan，CS）、纳米羟基磷灰石（nano Hydroxyapatite，HA）均是天然生物材料，具有无毒、良好的生物相容性及降解性［3～5］，分别在骨组织工程材料的应用研究中取得一定的成果。而单但独使用时都存在一些不足。前期实验将三者按1∶1∶1比例混合制备出SF／CS／n－HA生物支架，在考察其理化特性及表征的基础上得出三者材料混合比单独应用更合符骨组织工程要求［6］。骨髓间充质干细胞具有自我复制及向成骨细胞定向分化潜能而成为骨组织工程的理想种子细胞之一［7］。因此，本实验采用支架与骨髓间充质干细胞共培养通过MTT法及电镜检测其材料毒性。

1 材料与仪器

1.1 试剂及仪器 DMEM培养基、胰酶、胎牛血清（Hyelone公司）；MTT（Amresco公司）；DMSO（Amresco公司）；CO2细胞培养箱（Thermo，美国）；离心机（Thermo美国），倒置显微镜（奥林巴斯，日本）；超净工作台（苏州安泰有限公司）；扫描电镜（日立S－3400N，日本）；50万居里60CO辐照装置（贵州金农辐照科技有限公司）。

1.2 动物 新西兰大白兔，清洁级，1月龄，购于第三军医大学实验动物中心，实验动物生产许可证号：SCXK（渝）2012－0003；实验动物使用许可证号：SYXK（渝）2012－0002。实验过程参照2006年颁布的《关于善待实验动物的指导意见》对实验动物进行处置［8］。

2 方法

2.1 SF／CS／n－HA生物三维支架制备 将SF、CS、n－HA按1∶1∶1比例混合，采用冷冻干燥法制备出SF／CS／n－HA生物三维支架，并通过3000Gy60Co照射灭菌后保存备用［6］。经检测平均孔径为85.67μm，孔隙率91.25%±2.35%。

2.2 兔骨髓间充质细胞（bone marrow derived mesenchymal stem cells.BMSCs）分离培养 取新西兰大白兔，麻醉后消毒铺巾，取出双侧股骨，除去肌肉，PBS清洗。胶骨钳咬除两端骨骺，用Hanks液（含肝素抗凝）冲出骨髓，然后用200目过滤筛过滤。1000转／min离心5min，用含10%牛血清蛋白（FBS）低糖DMEM培养液反复吹打制成单细胞悬液接种于培养瓶，放于细胞培养箱中培养。48小时半换液，72小时小时全换液，以后视情况每隔两三天换液，待细胞生长至80%～85%时，用胰蛋白酶消化，按1：2进行传代培养，培养条件同原代。

2.3 支架体外细胞毒性实验 按培养基与支架体积比1ml／cm3为100%，37℃ 培养箱中浸提24小时，分别制备出浓度为100%、50%、25%浸提液。取第三代BMSCs，以细胞浓度为1×108／L每孔100μl接种到96孔板中，培养24小时后弃原培养基，更换为各浓度组浸提液，以加入完全基为阴性对照组，继续细胞箱中培养，分别于24、48、72h随机取一孔板，采用MTT法测定细胞活力。依据ISO10993.5－1999及 GB／T16886.5－2003标准，按下式计算出相对增殖率并评价支架的细胞毒性［9，10］。支架细胞毒性相对增殖率（RGR）＝各浓度实验组吸光值／阴性对照组吸光值×100%。

2.4 支架细胞活力测定 取第3代BMSCs，以细胞浓度为6×107／L，每孔接种100μl于96孔板中的SF／CS／n－HA支架作为实验组，以不放支架材料为对照组，细胞箱中培养，分别于1、3、5、7d随机取一孔板，MTT法测定各孔吸光值。

2.5 细胞黏附率测定 取第3代BMSCs，调整细胞浓度为5×107／L，每孔100μl接种在48孔板中的SF／CS／n－HA支架作为实验组，对照组为不放支架材料，于细胞箱中培养，分别于1、3、5h细胞计数板计数未附着细胞。细胞黏附率＝（接种细胞数－未附着细胞数）／接种细胞数×100%

2.6 细胞在支架上生长情况观察：每天倒置显微镜下观察支架周边细胞生长情况，支架与细胞共培养7天取出支架用2.5%戊二醛固定2小时，梯度酒精脱水，干燥，喷金，扫描电镜观察细胞生长。

2.7 统计学分析 采用SPSS 17.0统计软件进行数据分析，所得数据用表示。两者间比较采用独立样本t检验，以P＜0.05为有统计学差异。

3 结果

3.1 支架体外细胞毒性实验结果 分别测得个浓度组吸光值及阴性对照组吸光值，计算出RGR，通过与材料毒性等级（CTG）对比得出支架材料对BMSCs无细胞毒性，见表1、2。

表1 SF／CS／n－HA支架各浓度组浸提液与BMSCs培养的RGR和CTG（n＝8）Table 1 Various concentrations of SF／CS／n－HA scaffolds extract and BMSCs cultured RGR and CTG

表2 细胞毒性反应分级标准Table 2 Classification standard of cell toxicity

3.2 细胞增殖活力测定结果 随着时间的增长，细胞在支架上的数量明显增加，生长良好，支架材料实验组与对照组在第1、3、5、7d两组比较有统计学差异（P＜0.05），说明支架实验组随着时间增长细胞增殖活力优于不放支架材料的对照组，见表3。

表3 不同时间SF／CS／n－HA支架对细胞增殖活力OD值（，n＝4）Table 3 SF／CS／n－HA scaffolds on cell proliferation activity at different time

表3 不同时间SF／CS／n－HA支架对细胞增殖活力OD值（，n＝4）Table 3 SF／CS／n－HA scaffolds on cell proliferation activity at different time

注：①P＜0.05，VS对照组

组数 时间（d）1 3 5 7实验组 0.108±0.019①0.250±0.015①0.406±0.022①0.858±0.066①对照组 0.068±0.0020.162±0.0080.307±0.0480.612±0.011

3.3 细胞黏附结果 随着时间增加实验组与对照组细胞黏附率均增大，两组比较无统计学差异（P＞0.05），结果见表4。

3.4 BMSCs原代及传代培养形态 原代BMSCs接种24小时后开始出现梭形细胞，经半换液全换液除去未贴壁细胞，约72小时细胞开始增殖，生长良好，BMSCs成纤维状、长梭形。约7天时细胞生长回合达80%～90%。传代后细胞形态基本一致，细胞以梭形为主，增殖正常，6～8d时细胞可铺满瓶底，见图1。

表4 SF／CS／n－HA支架细胞黏附率［×10－2（，n＝6）］Table 4 SF／CS／n－HA scaffolds on cell adhesion rate

表4 SF／CS／n－HA支架细胞黏附率［×10－2（，n＝6）］Table 4 SF／CS／n－HA scaffolds on cell adhesion rate

1 3 5支架材料组黏附率组别 时间（h）77.500±0.06987.500±0.05289.167±0.038对照组黏附率75.833±0.07485.000±0.05586.667±0.052

图1 第三代BMSCs培养第7天（×100）Figure 1 The third generation of BMSCs at 7th day（×100）

3.5 细胞在支架上生长观察 倒置显微镜观察支架周边细胞生长良好，增殖正常，见图2。扫描电镜观察见细胞在支架材料上伸出伪足紧密黏附在支架孔隙表面。细胞为椭圆形、圆形或多角形，生长良好，分裂正常，见图3。

图2 SF／CS／n－HA支架复合BMSCs共培养7d（×100）Figure 2 SF／CS／n－HA scaffolds and BMSCs cultured at 7th d（×100）

4 讨论

骨缺损修复是骨科的重要研究课题之一。当前治疗骨缺损主要采用自体或异体骨移植，但都存在一定的弊端［11］。随着骨组织工程的发展，为骨缺损治疗带来了新的思路。支架材料、种子细胞、细胞因子是骨组织工程的研究热点［12］。一种理想的支架首先必须与种子细胞具有良好的生物相容性［13］。

图3 SF／CS／n－HA支架复合BMSCs共培养7dSEM（×2000）Figure 3 SF／CS／n－HA scaffolds and BMSCs cultured at 7th d（×2000）

目前材料的细胞毒性评价主要首选体外细胞毒性评价，通过MTT法检测种子细胞与支架材料共培养的相对增值率［14］。MTT法具有快速、重复性好、检测结果灵敏等特点而广泛用于生物材料的细胞毒性检测［15］。其检测原理为活细胞中具有丰富的琥珀酸脱氢酶，能将MTT还原成不容于水的蓝紫色结晶物质，而该结晶物质能溶解于DMSO，通过酶联免疫检测仪测定其吸光值来间接反映细胞存活量［16］。死细胞中无琥珀酸脱氢酶，不具备此功能。本实验采用的支架材料为实验组前期研究中制备的丝素蛋白／壳聚糖／纳米羟基磷灰石复合支架，通过检测具有符合骨组织工程支架材料的孔径、孔隙率等要求［6］。显示支架材料与组织来源不同的种子细胞具有不同的相容性［17］。因此，采用此材料与实验目的一致的种子细胞BMSCs体外共培养来评价支架材料的生物相容性，这样所得结果才更加准确和客观。

RGR进行细胞毒性分级评价是国内外学者广泛采用的方法［18］。理想的组织工程支架材料除了要求对种子细胞无毒性作用外，还应能促进种子细胞的黏附增殖［19］。

5 结论

BMSCs在CS／SF／n－HA复合支架上具有良好的黏附作用。随着时间的增加能明显促进BMSCs增殖，进一步表明此支架具有良好细胞相容性，是一种理想的骨组织工程支架。但该支架在体内的组织相容性、生物降解性、免疫源性及修复骨缺损的疗效需进一步研究。

［1］Panetta N J，Gupta D M，Longaker M T.Bone tissue engineer－ing scaffolds of today and tomorrow ［J］.J Craniofac Surg，2009，20（5）：1531－1532.

［2］Mcbane J E，Sharifpoor S，Cai K，et al.Biodegradation and in vivo biocompatibility of a degradable，polar／hydrophobic／ionic polyurethane for tissue engineering applications［J］.Biomaterials，2011，32（26）：6034－6044.

［3］Vepari C，Kaplan D L.Silk as a Biomaterial［J］.Prog Polym Sci，2007，32（8－9）：991－1007.

［4］王宇明，刘志辉，程凤梅，等.纳米羟基磷灰石的制备及表征［J］.化工科技，2010，（06）：13－16.

［5］邓 江，佘荣峰，黄文良，等.丝素蛋白／壳聚糖三维支架与骨髓间充质干细胞的体外培养［J］.中国组织工程研究，2012，16（25）：4677－4681.

［6］叶 鹏，田仁元，黄文良，等.丝素蛋白／壳聚糖／纳米羟基磷灰石构建的骨组织工程支架［J］.中国组织工程研究，2013，17（29）：5269－5274.

［7］Yoshikawa T.Bone regeneration by cultured bone graft：tissue engineering using cultured marrow cells ［J］.Tanpakushitsu Kakusan Koso，2000，45（13Suppl）：2289－2296.

［8］中华人民共和国科学技术部.关于善待实验动物指导性意见［J］.2006－09－30.

［9］INTERNATIONAL STANDARD ISO10993.5－1999，Biological evaluation of medical devices－Part 5.Tests for in vitro cytotoxicity.

［10］中华人民共和国国家标准GB／T16886.5－2003医疗器械生物学评价，第5部，分体外细胞毒性试验.

［11］Silva A M，Souza W M，Koivisto M B，et al.Miniplate fixation for the repair of segmental mandibular defects filled with autogenous bone in cats［J］.Acta Cir Bras，2011，26（3）：174－180.

［12］田志逢，秦书俭.骨组织工程中种子细胞与细胞支架复合培养的研究进展［J］.医学综述，2007，13（24）：1931－1933.

［13］李吉鹏，邓国英，赵庆华.种子细胞－支架复合体在骨组织修复中的研究进展［J］.中国矫形外科杂志，2012，20（20）：1857－1860.

［14］张燕搏，姜 明，王 强，等.组织工程血管材料体外细胞毒性评价实验研究［J］.中华实用诊断与治疗杂志，2011，25（06）：539－542.

［15］Qi R，Shen M，Cao X，et al.Exploring the dark side of MTT viability assay of cells cultured onto electrospun PLGA－based composite nanofibrous scaffolding materials［J］.Analyst，2011，136（14）：2897－2903.

［16］张文元，杨亚冬，房国坚.壳聚糖－丝素支架材料的细胞毒性检测［J］.中国卫生检验杂志，2010，20（10）：2395－2397.

［17］Cheung H S，Haak M H.Growth of osteoblasts on porous calcium phosphate ceramic：an in vitro model for biocompatibility study［J］.Biomaterials，1989，10（1）：63－67.

［18］Sha J M，Tao Y Q，Yan Z Y，et al.Cytotoxicity evaluation of hydroxyapatite on human umbilical cord vein endothelial cells for mechanical heart valve prosthesis applications［J］.Thorac Cardiovasc Surg，2009，57（2）：74－78.

［19］Kim B S，Mooney D J.Development of biocompatible synthetic extracellular matrices for tissue engineering ［J］.Trends Biotechnol，1998，16（5）：224－230.