高糖诱导大鼠心脏瓣膜间质细胞钙化的初步研究

呼海娟 陈会强 刘静 韩梅 崔炜

研究发现，糖尿病患者的细胞钙化程度高于正常人［1-2］，但具体机制还不清楚。而碱性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)是成骨细胞分化和功能成熟的早期的标志［2］，骨形态生成蛋白2(bone morphogeneticprotein2，BMP2)、BMP4(bone morphogenetic protein 4)能够调节相关细胞发生成骨样分化［3］。通过检测这几个相关指标可以反映细胞的骨化水平。因此，本实验通过检测上述指标探讨高糖在瓣膜钙化过程中是否发挥作用及其可能机制，旨在为钙化性心脏瓣膜病的发病机理提供实验依据。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 动物 健康成年雄性SD大鼠(清洁Ⅱ级)，体重250～280 g，由河北省实验动物中心提供，实验动物质量合格证明书编号:1402039。

1.1.2 主要试剂 DMEM高糖培养基(糖浓度25 mmol/L)、DMEM低糖培养基(糖浓度5.6 mmol/L)、甘露醇、胎牛血清、0.25%胰酶为Gibco产品;实验所用抗体购自Santa Cruz，epitomic公司;其他试剂盒均购自北京中杉公司。

1.2 方法

1.2.1 主动脉瓣间质细胞(aortic valve interstitial cell，AVIC)分离及培养 选取6～8只SD大鼠，经麻醉后固定于手术台上。75%酒精消毒胸腹部区域，之后迅速取出心脏，放入4℃预冷 PBS中，再移至超净台中充分漂洗。剔除心尖，沿左心室流出道将其剖开，充分暴露主动脉瓣。眼科镊刮拭主动脉瓣心室面，用显微镊、显微剪留取主动脉瓣，放入PBS中漂洗，之后将主动脉瓣铺于培养皿中，置于培养箱中培养。5～10 min后加入1 ml 10%DMEM高糖培养基。之后根据细胞生长情况，2～3 d换液一次。细胞在含10%胎牛血清的DMEM高糖培养基中生长至汇合后，0.25%胰蛋白酶消化传代，取4～6代细胞进行实验。待细胞生长至汇合80%～90%后换用无血清培养液饥饿培养24 h，使细胞同步于静止期，之后再恢复10%DMEM培养基继续培养不同时间，收集细胞用于实验。

1.2.2 免疫荧光染色鉴定 将处于对数生长期的AVIC接种于载玻片上，培养至50% ～60%密度后，用4%多聚甲醛固定细胞10 min，PBS漂洗，0.25%Triton X-100室温处理10 min，山羊血清室温封闭30 min，弃掉封闭液。分别加入相应的一抗二抗，最后用荧光显微镜观察并记录。

1.2.3 实验分组及钙化的诱导 呈对数期生长的瓣膜间质细胞，待密度达到80% ～90%时，给予撤血清24 h，之后恢复10%血清的培养基培养，并开始计时。实验分为 10%DMEM 低糖组(5.6 mmol/L)，10%DMEM 高糖组(25 mmol/L)，及10%DMEM低糖加甘露醇组(5.6 mmol/L+19.4 mmol/L)(所加甘露醇用以使该组渗透压与高糖组相同)。分别培养0、7和14 d，之后收集3个时间点的细胞用于测定其钙化程度。

1.2.4 Von-kossa染色测定钙化 收集上述3组细胞，弃培养皿内上清液，PBS洗5 min，4%多聚甲醛室温固定20 min，PBS洗5 min，清洗3次;1 ml/孔5% 硝酸银溶液紫外照射1 h，弃残液，PBS洗5 min，清洗3次;1 ml/孔5%硫代硫酸钠溶液室温5 min，弃残夜，PBS洗5 min，显微镜下观察拍照，黑色或棕色为阳性。

1.2.5 Western blot分析 取10%DMEM高糖(25 mmol/L)培养0、24、48和72 h的等量蛋白的提取液上样，进行SDS-PAGE。电转移至PVDF膜上。随后与一抗ALP、BMP2、BMP4及相应的二抗反应，用化学发光法检测抗原抗体结合区带。用数码成像分析系统软件对结果进行定量分析。

1.2.6 Real-time PCR分析 提取10%DMEM高糖(25 mmol/L)培养0、12、24、48 和72 h 的 RNA，将其反转录成cDNA，根据RT-PCR实验说明书进行加样操作，用AB7300仪器进行定量分析。

1.3 统计学方法

2 结果

2.1 主动脉瓣膜间质细胞鉴定

该细胞显微镜下胞体呈多边形、三角形或不规则形，可见多个分裂状。免疫荧光染色分析结果表明，该细胞表达α-SMA和波形蛋白vimentin，为主动脉瓣膜间质细胞，见图1。

图1 主动脉瓣膜间质细胞荧光染色图像(×100)

2.2 主动脉瓣膜间质细胞钙化测定

Von-kossa染色分析显示，低糖组(5.6 mmol/L)和低糖加甘露醇组(5.6+19.4)mmol/L在3个时间点均没有检测到钙化结节，表明在低糖浓度的作用下，随着培养时间的延长，细胞没有发生钙化，见图2。而在高糖组(25 mmol/L)，0 d时细胞经染色后无着色点，为阴性;7d时细胞灶经染色后为弱阳性，阳性面积较小，阳性细胞灶数量较少;14 d时细胞灶经von-kossa染色后为强阳性，阳性面积较大，出现大量钙化，见图3。

2.3 主动脉瓣膜间质细胞骨化相关因子蛋白水平检测

为进一步分析瓣膜间质细胞在高糖作用下发生骨化的早期分子学机制，本实验收取高糖(25 mmol/L)培养0、24、48、72 h 的蛋白进行测定。Western blot结果显示，主动脉瓣膜间质细胞融合后继续培养不同时间点，ALP的表达呈现逐渐增高的态势，表明有向成骨细胞转化的趋势。BMP2及BMP4能够诱导细胞发生成骨样分化，因而对其进行检测。结果表明，BMP2、BMP4在0及24 h几乎没有表达;48 h时BMP2、BMP4有少量表达;72 h时BMP2、BMP4表达较48 h相比明显增加，差异具有统计学意义(均为P＜0.05)，见图4。

2.4 主动脉瓣膜间质细胞骨化相关因子转录水平测定

分别收取高糖(25 mmol/L)培养 0、12、24、48 h及72 h的RNA进行测定。Real-time PCR结果显示，主动脉瓣膜间质细胞融合后继续培养不同时间时，ALP的转录水平呈现逐渐增高的态势，表明有向成骨细胞转化的趋势。进而对部分BMP2，BMP4的转录水平进行检测，在0 h时，BMP2、BMP4几乎没有表达;12、24 h时，BMP2、BMP4有少量表达;48、72 h时，BMP2、BMP4表达较24 h相比增加明显(均为P＜0.05)，见图5。相关引物序列见表1。

图2 主动脉瓣膜间质细胞在低糖条件下培养0、7、14 d的von-kossa染色(×100)

图3 主动脉瓣膜间质细胞在高糖条件下培养0、7、14 d的von-kossa染色(×100)

图4 主动脉瓣膜间质细胞骨化相关因子蛋白水平检测

3 讨论

图5 主动脉瓣膜间质细胞骨化相关因子转录水平检测

表1 本实验用到的实时定量PCR引物序列

随着生活水平的不断改善以及人口的老龄化，糖尿病的发病率逐年增高。糖尿病患者广泛都存在血管钙化，血管钙化是糖尿病患者心血管疾病发病和死亡的主要独立危险因素［4-5］。因此，本研究选择糖浓度作为影响因素［6］，观察其对于主动脉瓣膜间质细胞钙化是否发挥作用。本实验分别用低糖、高糖及低糖加甘露醇培养瓣膜间质细胞不同时间［6］，结果显示，低糖组和低糖加甘露醇组均没有钙化结节出现，而在高糖组，细胞培养7和14 d后均出现了不同程度的钙化结节，表明随着高糖刺激时间的延长，主动脉瓣膜间质细胞确实发生了钙化。3组结果比较表明，钙化形成主要为高糖所诱导，而渗透压对钙化的形成没有影响。因此，对于糖尿病患者，积极控制饮食，降低血糖浓度，可能能够延缓或者遏制瓣膜钙化的形成。由于细胞钙化是与骨化因子的表达有关，因此我们观察了与钙化相关的部分骨化因子的表达。结果显示，高糖诱导的主动脉瓣膜间质细胞的钙化与骨化因子ALP、BMP2、BMP4表达增加有关。

在细胞钙化早期，ALP的活性增强，ALP的作用主要是将有机磷酸化合物分解成无机磷酸盐，使之与钙离子结合形成羟磷灰石沉积于骨组织;同时能将焦磷酸盐水解，使之失活，解除其对骨化的抑制作用。其表达和活性常被用作成骨细胞分化和功能成熟的早期的标志。因此，本研究中，我们对ALP基因水平和蛋白表达水平进行了研究，发现ALP活性随着培养时间增加而增加，表明瓣膜间质细胞在培养过程中逐渐转化为成骨细胞表型。

骨形成蛋白属于转化生长因子TGF-β超家族成员。在病理情况下，主要通过旁分泌的方式调节相关细胞发生成骨细胞分化。本研究中，BMP2、BMP4蛋白表达水平及mRNA转录水平均随培养时间延长而增加，在72 h时达峰值。有学者在CAS患者瓣叶检测到BMPs，研究证实BMP2参与AVICs的钙化过程［7-8］，可能与BMP2刺激后Cbfal和骨桥蛋白表达明显增加有关［9］。

综上所述，在高糖持续作用下，主动脉瓣膜间质细胞培养一定时间后，骨化相关因子的表达增加，有向成骨细胞转化的趋势，为钙化性心脏瓣膜病的预防和治疗提供依据。本实验不足之处在于仅在细胞培养过程中观察到此现象，对其内在的具体机制缺乏探索，下一步将就其内在机制进行深入研究。

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［2］Wang Z，Jiang Y，Liu N，et al.Advanced glycation end-product Nepsilon-carboxymethyl-Lysine accelerates progression of atherosclerotic calcification in diabetes ［J］.Atherosclerosis，2012，221:387-396.

［3］Tan TW，Huang YL，Chang JT，et al.CCN3 increases BMP-4 expression and bone mineralization in osteoblasts［J］.J Cell Physiol，2012，227:2531-2541.

［4］Wang WD，Li GP.Correlation between advanced glycosylation end products and the severity of coronary artery disease［J］.Chin J Cardiovascular Med，2013，18:260-263.(in Chinese)王卫定，李广平.晚期糖基化终产物与冠状动脉病变程度的相关性分析［J］.中国心血管杂志，2013，18:260-263.

［5］Nguyen N，Naik V，Speer MY.Diabetes mellitus accelerates cartilaginous metaplasia and calcification in atherosclerotic vessels of LDLr mutant mice ［J］.Cardiovasc Pathol，2013，22:167-175.

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［7］Nigam V，Srivastava D.Notch1 represses osteogenic pathways in aortic valve cells［J］.J Mol Cell Cardiol，2009，47:828-834.

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［9］Yang X，Meng X，Su X，et al.Bone morphogenic protein 2 induces Runx2 and osteopontin expression in human aortic valve interstitial cells:role of Smad1 and extracellular signal-regulated kinase 1/2 ［J］.J Thorac Cardiovasc Surg，2009，138:1008-1015.