溶血对时间分辨免疫荧光分析法测定胰岛素的影响

谢伟贤，黄泽棋，王晓娟，韩慧明（．广东省佛山市第二人民医院检验科 58000；．佛山科学技术学院检药系，广东佛山 58000）

体外溶血主要由部分物理性因素所致，包括抽血时负压过大及标本处理过程中涉及的冰冻、水浴箱温度过高、机械震荡等。人体内的胰岛素来自于胰岛β细胞，外周血胰岛素水平可反映胰岛素的分泌及代谢速率。外周血胰岛素水平检测对糖尿病的分型及疗效评价具有重要作用［1］。红细胞内含有胰岛素降解酶（IDE），溶血可使其从红细胞内释放入血清中，降解胰岛素，从而影响胰岛素水平的检测［2－3］。本研究选择不同溶血程度标本，并在溶血后的不同时间段，采用时间分辨免疫荧光分析法进行血清胰岛素水平检测，旨在了解溶血程度和溶血时间对血清胰岛素检测结果影响，以期为指导临床工作及正确理解溶血对免疫学方法检测指标的检测结果的影响奠定基础［4－6］。

1 材料与方法

1．1 标本来源 本研究涉及的外周血标本采集自佛山市第二人民医院收治的具有不同胰岛素水平的患者30例，包括处于正常参考区间者10例、低于正常参考区间下限者10例、高于正常参考区间上限者10例。所有标本无溶血、黄疸及脂血，并于－80℃条件下保存。

1．2 试剂与仪器 XE－5000全自动血细胞分析仪（日本Sysmex公司），Anytest时间分辨荧光免疫分析仪及配套的胰岛素检测试剂盒（苏州新波生物技术有限公司）。

1．3 方法

1．3．1 标本处理 从冰箱中取出标本，室温中复温、混匀后3 200r／min离心5min，分离血清标本。

1．3．2 血红蛋白（Hb）标准浓度液的配制 取1 000μL Hb浓度为154g／L的乙二胺四乙酸二钾抗凝全血，与500μL蒸馏水混匀，－20℃条件下保存24h，即可获得Hb浓度为100 g／L的标准浓度液。

1．3．3 不同程度溶血标本的制备 根据美国临床和实验室标准化协会（CLSI）的文件，将溶血程度分为轻度溶血（血清Hb浓度0～1g／L）、中度溶血（血清Hb浓度为1～5g／L）、重度溶血（血清Hb浓度为大于5g／L）。将分离获得的血清标本分成990、980、950μL共3管，分别加入10、20、50μL Hb标准浓度液，即可获得血清Hb浓度分别为1、2、5g／L的溶血标本。

1．3．4 胰岛素水平检测 室温环境下，于溶血标本配制后0、0．5、2、18h分别进行非溶血标本和溶血标本胰岛素水平检测。操作严格按照仪器和试剂盒说明书进行。

1．4 统计学处理 采用SPSS17．0软件进行数据处理和统计学分析。计量资料以±s表示，两组间比较采用配对t检验，多组间比较采用方差分析或重复测量数据的方差分析，并绘制相应的曲线；P＜0．05为比较差异有统计学意义。

2 结 果

2．1 溶血程度对血清胰岛素检测结果的影响 未溶血组、轻度溶血组、中度溶血组、重度溶血组血清标本胰岛素检测结果分别为（28．3±37．76）、（21．23±26．56）、（17．65±22．65）、（12．26±15．34）μIU／mL，轻度溶血组、中度溶血组、重度溶血组的检测结果均低于未溶血组，与未溶血组比较，配对t检验P值均小于0．05；轻度溶血组检测结果高于中度溶血组、重度溶血组，但配对t检验显示比较差异均无统计学意义（P＞0．05）；中度溶血组检测结果高于重度溶血组，但配对t检验显示比较差异无统计学意义（P＞0．05）。

2．2 溶血时间对血清胰岛素检测结果的 仅考虑溶血时间对胰岛素检测结果的影响时，0、0．5、2、18h检测结果分别为（28．3±37．76）、（23．22±29．63）、（18．1±23．57）、（9．81±11．34）μIU／mL，其中0．5、2、18h胰岛素检测结果均低于0h检测结果，配对t检验显示比较差异均有统计学意义（P＜0．05）；0．5h胰岛素检测结果高于2h检测结果，但二者比较差异无统计学意义（P＞0．05）；0．5h胰岛素检测结果高于18 h检测结果，且二者比较差异有统计学意义（P＜0．05）；2h胰岛素检测结果高于18h检测结果，且二者比较差异有统计学意义（P＜0．05）。溶血标本不同时间点胰岛素检测结果呈下降趋势（见图1），且溶血标本不同时间点胰岛素检测结果比较差异有统计学意义（F＝18．424，P＜0．05），溶血时间越长，胰岛素水平下降越明显。

图1 胰岛素水平随溶血时间变化的曲线图

2．3 溶血程度和溶血时间对胰岛素检测结果的综合影响 当考虑溶血程度和溶血时间对血清胰岛素检测结果的综合影响时，检测结果数据分析见表1及图2。在不同溶血程度组中，不同时间点胰岛素结果分析显示，轻度溶血组、中度溶血组、重度溶血组的溶血时间为0．5h时的胰岛素检测结果与溶血时间为2h的检测结果相比，比较差异均无统计学意义，P值均大于0．05，但2h与18h检测结果相比，比较差异均有统计学意义（P＜0．05）；0．5h与18h检测结果相比，比较差异均有统计学意义（P＜0．05）。重复测量设计的方差分析显示，不同溶血程度标本与溶血时间对胰岛素检测结果的影响比较差异有统计学意义（F＝3．269，P＜0．05），说明在不同溶血标本组内，胰岛素检测结果随时间变化的趋势不同；胰岛素检测结果在3个时间段内随时间变化呈成线性变化（F＝19．942，P＜0．05）；不同溶血程度组间胰岛素检测结果相比，比较差异则无统计学意义（F＝1．122，P＞0．05）。

表1 溶血程度和溶血时间对血清胰岛素的影响

图2 胰岛素检测结果随溶血程度和时间变化的趋势

3 讨 论

时间分辨免疫荧光分析法是测定胰岛素水平的常用方法之一，具有检测成本低、灵敏度高等优点。在临床检验工作中，标本溶血的现象并不少见。随着红细胞破裂，IDE释放进入血清中，导致溶血标本血清胰岛素浓度下降。本研究结果也显示，不同溶血程度标本胰岛素检测结果与未溶血标本检测结果比较差异具有统计学意义（P＜0．05），但Hb浓度对胰岛素检测结果影响的差异并无统计学意义（P＞0．05），与溶血时间却有一定的相关性（P＜0．05）。随着溶血时间的延长，胰岛素浓度也会下降。因此，对于存在溶血现象的标本，应尽量选择重新采集标本，否则应尽快检测，并在结果报告单中标明“标本溶血”等字样。

出现本研究结果的原因可能有三方面因素：（1）本研究中溶血标本的制备使用的是来源于健康者的Hb。有研究证实，2型糖尿病患者红细胞内的IDE活性显著高于健康者，即健康者的红细胞IDE活性较低，轻度溶血的情况下就能达到饱和状态，且在很长的一段时间内都保持相同的降解速度，导致2h内检测结果无明显差异［3］。这与其他研究报道的胰岛素浓度下降程度与溶血程度呈正相关，即溶血程度越高，其浓度下降越明显有所不同［7］。（2）可能是由于标本量较少，导致部分数据间无明显差异。本研究仅使用了30例标本，或许未能充分反映溶血程度导致的检测结果之间的差异性。（3）时间分辨免疫荧光分析法定量检测胰岛素对实验结果存在一定的影响。采用时间分辨免疫荧光分析法进行检测时，手工操作步骤相对较多，所需时间较长，影响结果的因素也相应较多。因此，在临床检测工作中，应特别注意以下事项：专人操作以保证操作手法的一致性；将实验温度控制在恒定状态（最好为25℃）；保证实验环境、仪器的清洁；不同批号的试剂、校准品不能混用；铕标记物稀释后应在1h内使用，加样时保持吸头的均匀通畅，微孔板的震荡时间必须保证至少5min；洗液必须临用前配制［8］。只有控制好实验操作中的各个步骤和环节，尽可能克服上述各种因素的影响，才能获得满意的实验结果，为临床医师的提供尽可能准确、客观的辅助诊断数据。

本研究初步探讨了溶血对时间分辨免疫荧光分析法定量检测胰岛素的影响，在以后的研究中可增加相应的纠正措施，并通过二元一次方程确定溶血程度、胰岛素检测结果和标本真实值三者的关系，并用回归方程纠正其影响［9－10］。

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