金属螯合固相萃取整体柱的制备及其性能研究

赵书林等

摘要：基于金属螯合物中Cu2+与氨基硫醇类化合物（如半胱氨酸的SH基团）之间的亲和作用，设计合成了一种金属螯合整体柱，并用作固相萃取吸附剂。实验以亚氨基二乙酸（IDA）三齿配体为中间介质，通过化学修饰法键合在聚（甲基丙烯酸缩水甘油酯乙二醇二甲基丙烯酸酯）（poly（GMAcoEDMA））整体柱孔表面，再利用配位结合作用螯合Cu2+，合成 poly（GMAcoEDMAIDA Cu2+） 整体柱。实验以谷胱甘肽为探针测试化合物，考察了该整体柱固定相的萃取性能，并优化了实验条件。在最佳实验条件下，此整体柱对谷胱甘肽的吸附容量为43.15 mg/g，并能有效富集人血浆样品中的氨基硫醇类化合物。

关键词：金属螯合物； 聚合物整体柱； 固相萃取； 氨基硫醇

1引言

近年来，在生物样品预处理领域中，整体柱得到了快速发展[1]。整体柱的比表面积大，可以使萃取介质的体积大大增加，从而提高萃取容量；而且整体柱的制备比较简单，生物相容性好；使用整体柱作萃取柱，其特有的穿透孔为液体的流动提供了大孔通道，明显减小传质阻力，提高萃取效率；此外，在萃取过程中，聚合物整体柱具有很好的重复性， 在较宽的pH范围内具有极高的稳定性[2～4]。Zhang等[5]通过戊二醛法将酶固定于聚（丙烯酰胺甲叉双丙烯酰胺）整体柱上制备固定酶微反应器，并用于消解牛血清白蛋白（BSA）。Sinz课题组[6]过戊二醛法分别在聚（甲基丙烯酸缩水甘油酯丙烯酰胺二甲基丙烯酸酯）柱和聚（甲基丙烯酸缩水甘油酯二甲基丙烯酸酯）柱 （poly（GMAcoEDMA）） 表面修饰上单体抗生物素蛋白，用于捕获乙二醇BSA。

过渡金属离子易与螯合剂中的N， O和S原子以配位键形式连接，形成金属螯合物。这些金属螯合物与位于蛋白质表面组氨酸的咪唑基、氨基硫醇（如半胱氨酸）的巯基，以及色氨酸的吲哚基发生亲和作用。目前，金属螯合亲和色谱已经成功应用于蛋白质以及多肽的工业生产。Ma等[7]在二氧化硅磁纳米粒子上修饰亚氨基二乙酸（IDA），通入Cu2+制备金属铜螯合物，用于富集BSA。Ensinger研究组[8]在表面含有羧基的纳米孔内固定带有氨基的三联吡啶（terPy），通入Fe2+制得Fe2+terPy螯合物，并用作生物传感器，识别生物分子如乳铁蛋白。此外，这类材料还可以处理肽类物质及某些药物。Wang等[9]合成了聚甲基丙烯酸甲酯二乙烯基苯（poly（MAcoDVB）） 磁性微球，并以IDA三齿配体作为中间介质，螯合Cu2+制备了poly（MAcoDVB）IDACu磁性微球螯合物，用作富集谷胱甘肽。Gu等[10]以IDA作有机配体，合成了Cu和Fe金属螯合物，用于富集含糖肽的博来霉素抗癌药物。

本研究结合金属螯合物和有机聚合物整体柱的优点，设计合成一种金属螯合亲和整体柱，用于固相萃取吸附剂。利用IDA 三齿配体为中间介质，将其键合在 poly（GMAcoEDMA） 聚合物基质整体柱表面，再螯合 Cu2+，制得毛细管固相萃取整体柱。以谷胱甘肽等含有巯基的氨基硫醇类化合物为分析测试物，详细考察此整体柱的萃取性能。

2实验部分

2.1试剂与仪器

2.2制备金属螯合整体柱

3.3氨基硫醇类化合物的预分离富集

将GSH， Cys和HCys 3种混合物标准溶液经poly（GMAcoEDMAIDACu2+）整体柱和poly（GMAcoEDMA） 基质整体柱预处理后进行电泳分析，如图9所示。从图9可见， poly（GMAcoEDMAIDACu2+）整体柱对3种含巯基的氨基硫醇化合物具有明显的富集作用。

实验还以加标人血浆样品为分析测试物，考察poly（GMAcoEDMAIDACu2+）整体柱对复杂样品中氨基硫醇类化合物的富集性能。图10a 是加标GSH、Cys和HCys标准溶液的血浆样品的电泳分析图，血浆样品的复杂基质严重干扰了GSH， Cys和HCys 这3种物质的分离检测。图10c 是将poly（GMAcoEDMA） 作为固相萃取整体柱对血浆样品进行预处理后的电泳图，可见它并不能有效地去除基质的干扰。加标血浆样品经poly（GMAcoEDMAIDACu2+） 整体柱预处理之后，成功检测到了GSH， Cys和HCys这3种物质，避免了复杂血浆样品的基质干扰（图10b）。

4结论

本研究基于金属螯合物中Cu2+与氨基硫醇如半胱氨酸的SH功能团间的亲和作用，在大孔径的毛细管内合成了 poly（GMAcoEDMAIDACu2+） 整体柱，用作固相萃取吸附剂。实验以GSH、Cys和HCys作为分析测试化合物，考察了其萃取性能。结果表明，此整体柱对巯基化合物具有较好的选择性，较大的吸附容量且可重复使用。此外，该固相萃取整体柱的制备方法简单，预处理过程简便、快速，有望应用于实际样品中巯基化合物的预分离富集。

References

1Namera A， Saito T. TrACTrends Anal. Chem.， 2013， 45： 182-196

2DING MingYu， ZHENG Rui， PENG Hong. Chinese J. Anal. Chem.， 2009， 37（3）： 395-398

3Fan Y， Feng Y， Zhang J. Da S， Zhang M. J. Chromatogr. A， 2005， 1074（12）： 9-16

4Potter O G， Hilder E F. J. Sep. Sci.， 2008， 31（11）： 1881-1906

5Wu S， Sun L， Ma J， Yang K， Liang Z， Zhang L， Zhang Y. Talanta， 2011， 83（5）： 1748-1753

6Spro J， Sinz A. Anal. Bioanal. Chem.， 2012， 402（7）： 2395-2405

7Ma Z， Guan Y， Liu H. J. Magn. Magn. Mater.， 2006， 301（2）： 469-477

8Ali M， Nasir S， Nguyen Q H， Sahoo J K， Tahir M N， Tremel W， Ensinger W. J. Am. Chem. Soc.， 2011， 133（43）： 17307-17314

9Wang Q， Guan Y， Yang M. J. Magn. Magn. Mater.， 2012， 324（20）： 3300-3305

10Gu J， Codd R. J. Inorg. Biochem.， 2012， 115： 198-203

11YE FangGui， HAN YanYan， WANG Shun， HUANG BaoJun， ZHAO ShuLin. Chinese J. Anal. Chem.， 2010， 38（2）： 192-196

12ZHANG AiZhu， YE FangGui， LU JunYu， WEI Zong， PENG Yan， ZHAO ShuLin. Chinese J. Anal. Chem.， 2011， 39（8）： 1247-1250

13Zhang M， Wei F， Zhang Y， Nie J， Feng Y. J. Chromatogr. A， 2006， 1102（12）： 294-301

摘要：基于金属螯合物中Cu2+与氨基硫醇类化合物（如半胱氨酸的SH基团）之间的亲和作用，设计合成了一种金属螯合整体柱，并用作固相萃取吸附剂。实验以亚氨基二乙酸（IDA）三齿配体为中间介质，通过化学修饰法键合在聚（甲基丙烯酸缩水甘油酯乙二醇二甲基丙烯酸酯）（poly（GMAcoEDMA））整体柱孔表面，再利用配位结合作用螯合Cu2+，合成 poly（GMAcoEDMAIDA Cu2+） 整体柱。实验以谷胱甘肽为探针测试化合物，考察了该整体柱固定相的萃取性能，并优化了实验条件。在最佳实验条件下，此整体柱对谷胱甘肽的吸附容量为43.15 mg/g，并能有效富集人血浆样品中的氨基硫醇类化合物。

关键词：金属螯合物； 聚合物整体柱； 固相萃取； 氨基硫醇

1引言

近年来，在生物样品预处理领域中，整体柱得到了快速发展[1]。整体柱的比表面积大，可以使萃取介质的体积大大增加，从而提高萃取容量；而且整体柱的制备比较简单，生物相容性好；使用整体柱作萃取柱，其特有的穿透孔为液体的流动提供了大孔通道，明显减小传质阻力，提高萃取效率；此外，在萃取过程中，聚合物整体柱具有很好的重复性， 在较宽的pH范围内具有极高的稳定性[2～4]。Zhang等[5]通过戊二醛法将酶固定于聚（丙烯酰胺甲叉双丙烯酰胺）整体柱上制备固定酶微反应器，并用于消解牛血清白蛋白（BSA）。Sinz课题组[6]过戊二醛法分别在聚（甲基丙烯酸缩水甘油酯丙烯酰胺二甲基丙烯酸酯）柱和聚（甲基丙烯酸缩水甘油酯二甲基丙烯酸酯）柱 （poly（GMAcoEDMA）） 表面修饰上单体抗生物素蛋白，用于捕获乙二醇BSA。

过渡金属离子易与螯合剂中的N， O和S原子以配位键形式连接，形成金属螯合物。这些金属螯合物与位于蛋白质表面组氨酸的咪唑基、氨基硫醇（如半胱氨酸）的巯基，以及色氨酸的吲哚基发生亲和作用。目前，金属螯合亲和色谱已经成功应用于蛋白质以及多肽的工业生产。Ma等[7]在二氧化硅磁纳米粒子上修饰亚氨基二乙酸（IDA），通入Cu2+制备金属铜螯合物，用于富集BSA。Ensinger研究组[8]在表面含有羧基的纳米孔内固定带有氨基的三联吡啶（terPy），通入Fe2+制得Fe2+terPy螯合物，并用作生物传感器，识别生物分子如乳铁蛋白。此外，这类材料还可以处理肽类物质及某些药物。Wang等[9]合成了聚甲基丙烯酸甲酯二乙烯基苯（poly（MAcoDVB）） 磁性微球，并以IDA三齿配体作为中间介质，螯合Cu2+制备了poly（MAcoDVB）IDACu磁性微球螯合物，用作富集谷胱甘肽。Gu等[10]以IDA作有机配体，合成了Cu和Fe金属螯合物，用于富集含糖肽的博来霉素抗癌药物。

本研究结合金属螯合物和有机聚合物整体柱的优点，设计合成一种金属螯合亲和整体柱，用于固相萃取吸附剂。利用IDA 三齿配体为中间介质，将其键合在 poly（GMAcoEDMA） 聚合物基质整体柱表面，再螯合 Cu2+，制得毛细管固相萃取整体柱。以谷胱甘肽等含有巯基的氨基硫醇类化合物为分析测试物，详细考察此整体柱的萃取性能。

2实验部分

2.1试剂与仪器

2.2制备金属螯合整体柱

3.3氨基硫醇类化合物的预分离富集

将GSH， Cys和HCys 3种混合物标准溶液经poly（GMAcoEDMAIDACu2+）整体柱和poly（GMAcoEDMA） 基质整体柱预处理后进行电泳分析，如图9所示。从图9可见， poly（GMAcoEDMAIDACu2+）整体柱对3种含巯基的氨基硫醇化合物具有明显的富集作用。

实验还以加标人血浆样品为分析测试物，考察poly（GMAcoEDMAIDACu2+）整体柱对复杂样品中氨基硫醇类化合物的富集性能。图10a 是加标GSH、Cys和HCys标准溶液的血浆样品的电泳分析图，血浆样品的复杂基质严重干扰了GSH， Cys和HCys 这3种物质的分离检测。图10c 是将poly（GMAcoEDMA） 作为固相萃取整体柱对血浆样品进行预处理后的电泳图，可见它并不能有效地去除基质的干扰。加标血浆样品经poly（GMAcoEDMAIDACu2+） 整体柱预处理之后，成功检测到了GSH， Cys和HCys这3种物质，避免了复杂血浆样品的基质干扰（图10b）。

4结论

本研究基于金属螯合物中Cu2+与氨基硫醇如半胱氨酸的SH功能团间的亲和作用，在大孔径的毛细管内合成了 poly（GMAcoEDMAIDACu2+） 整体柱，用作固相萃取吸附剂。实验以GSH、Cys和HCys作为分析测试化合物，考察了其萃取性能。结果表明，此整体柱对巯基化合物具有较好的选择性，较大的吸附容量且可重复使用。此外，该固相萃取整体柱的制备方法简单，预处理过程简便、快速，有望应用于实际样品中巯基化合物的预分离富集。

References

1Namera A， Saito T. TrACTrends Anal. Chem.， 2013， 45： 182-196

2DING MingYu， ZHENG Rui， PENG Hong. Chinese J. Anal. Chem.， 2009， 37（3）： 395-398

3Fan Y， Feng Y， Zhang J. Da S， Zhang M. J. Chromatogr. A， 2005， 1074（12）： 9-16

4Potter O G， Hilder E F. J. Sep. Sci.， 2008， 31（11）： 1881-1906

5Wu S， Sun L， Ma J， Yang K， Liang Z， Zhang L， Zhang Y. Talanta， 2011， 83（5）： 1748-1753

6Spro J， Sinz A. Anal. Bioanal. Chem.， 2012， 402（7）： 2395-2405

7Ma Z， Guan Y， Liu H. J. Magn. Magn. Mater.， 2006， 301（2）： 469-477

8Ali M， Nasir S， Nguyen Q H， Sahoo J K， Tahir M N， Tremel W， Ensinger W. J. Am. Chem. Soc.， 2011， 133（43）： 17307-17314

9Wang Q， Guan Y， Yang M. J. Magn. Magn. Mater.， 2012， 324（20）： 3300-3305

10Gu J， Codd R. J. Inorg. Biochem.， 2012， 115： 198-203

11YE FangGui， HAN YanYan， WANG Shun， HUANG BaoJun， ZHAO ShuLin. Chinese J. Anal. Chem.， 2010， 38（2）： 192-196

12ZHANG AiZhu， YE FangGui， LU JunYu， WEI Zong， PENG Yan， ZHAO ShuLin. Chinese J. Anal. Chem.， 2011， 39（8）： 1247-1250

13Zhang M， Wei F， Zhang Y， Nie J， Feng Y. J. Chromatogr. A， 2006， 1102（12）： 294-301

摘要：基于金属螯合物中Cu2+与氨基硫醇类化合物（如半胱氨酸的SH基团）之间的亲和作用，设计合成了一种金属螯合整体柱，并用作固相萃取吸附剂。实验以亚氨基二乙酸（IDA）三齿配体为中间介质，通过化学修饰法键合在聚（甲基丙烯酸缩水甘油酯乙二醇二甲基丙烯酸酯）（poly（GMAcoEDMA））整体柱孔表面，再利用配位结合作用螯合Cu2+，合成 poly（GMAcoEDMAIDA Cu2+） 整体柱。实验以谷胱甘肽为探针测试化合物，考察了该整体柱固定相的萃取性能，并优化了实验条件。在最佳实验条件下，此整体柱对谷胱甘肽的吸附容量为43.15 mg/g，并能有效富集人血浆样品中的氨基硫醇类化合物。

关键词：金属螯合物； 聚合物整体柱； 固相萃取； 氨基硫醇

1引言

近年来，在生物样品预处理领域中，整体柱得到了快速发展[1]。整体柱的比表面积大，可以使萃取介质的体积大大增加，从而提高萃取容量；而且整体柱的制备比较简单，生物相容性好；使用整体柱作萃取柱，其特有的穿透孔为液体的流动提供了大孔通道，明显减小传质阻力，提高萃取效率；此外，在萃取过程中，聚合物整体柱具有很好的重复性， 在较宽的pH范围内具有极高的稳定性[2～4]。Zhang等[5]通过戊二醛法将酶固定于聚（丙烯酰胺甲叉双丙烯酰胺）整体柱上制备固定酶微反应器，并用于消解牛血清白蛋白（BSA）。Sinz课题组[6]过戊二醛法分别在聚（甲基丙烯酸缩水甘油酯丙烯酰胺二甲基丙烯酸酯）柱和聚（甲基丙烯酸缩水甘油酯二甲基丙烯酸酯）柱 （poly（GMAcoEDMA）） 表面修饰上单体抗生物素蛋白，用于捕获乙二醇BSA。

过渡金属离子易与螯合剂中的N， O和S原子以配位键形式连接，形成金属螯合物。这些金属螯合物与位于蛋白质表面组氨酸的咪唑基、氨基硫醇（如半胱氨酸）的巯基，以及色氨酸的吲哚基发生亲和作用。目前，金属螯合亲和色谱已经成功应用于蛋白质以及多肽的工业生产。Ma等[7]在二氧化硅磁纳米粒子上修饰亚氨基二乙酸（IDA），通入Cu2+制备金属铜螯合物，用于富集BSA。Ensinger研究组[8]在表面含有羧基的纳米孔内固定带有氨基的三联吡啶（terPy），通入Fe2+制得Fe2+terPy螯合物，并用作生物传感器，识别生物分子如乳铁蛋白。此外，这类材料还可以处理肽类物质及某些药物。Wang等[9]合成了聚甲基丙烯酸甲酯二乙烯基苯（poly（MAcoDVB）） 磁性微球，并以IDA三齿配体作为中间介质，螯合Cu2+制备了poly（MAcoDVB）IDACu磁性微球螯合物，用作富集谷胱甘肽。Gu等[10]以IDA作有机配体，合成了Cu和Fe金属螯合物，用于富集含糖肽的博来霉素抗癌药物。

本研究结合金属螯合物和有机聚合物整体柱的优点，设计合成一种金属螯合亲和整体柱，用于固相萃取吸附剂。利用IDA 三齿配体为中间介质，将其键合在 poly（GMAcoEDMA） 聚合物基质整体柱表面，再螯合 Cu2+，制得毛细管固相萃取整体柱。以谷胱甘肽等含有巯基的氨基硫醇类化合物为分析测试物，详细考察此整体柱的萃取性能。

2实验部分

2.1试剂与仪器

2.2制备金属螯合整体柱

3.3氨基硫醇类化合物的预分离富集

将GSH， Cys和HCys 3种混合物标准溶液经poly（GMAcoEDMAIDACu2+）整体柱和poly（GMAcoEDMA） 基质整体柱预处理后进行电泳分析，如图9所示。从图9可见， poly（GMAcoEDMAIDACu2+）整体柱对3种含巯基的氨基硫醇化合物具有明显的富集作用。

实验还以加标人血浆样品为分析测试物，考察poly（GMAcoEDMAIDACu2+）整体柱对复杂样品中氨基硫醇类化合物的富集性能。图10a 是加标GSH、Cys和HCys标准溶液的血浆样品的电泳分析图，血浆样品的复杂基质严重干扰了GSH， Cys和HCys 这3种物质的分离检测。图10c 是将poly（GMAcoEDMA） 作为固相萃取整体柱对血浆样品进行预处理后的电泳图，可见它并不能有效地去除基质的干扰。加标血浆样品经poly（GMAcoEDMAIDACu2+） 整体柱预处理之后，成功检测到了GSH， Cys和HCys这3种物质，避免了复杂血浆样品的基质干扰（图10b）。

4结论

本研究基于金属螯合物中Cu2+与氨基硫醇如半胱氨酸的SH功能团间的亲和作用，在大孔径的毛细管内合成了 poly（GMAcoEDMAIDACu2+） 整体柱，用作固相萃取吸附剂。实验以GSH、Cys和HCys作为分析测试化合物，考察了其萃取性能。结果表明，此整体柱对巯基化合物具有较好的选择性，较大的吸附容量且可重复使用。此外，该固相萃取整体柱的制备方法简单，预处理过程简便、快速，有望应用于实际样品中巯基化合物的预分离富集。

References

1Namera A， Saito T. TrACTrends Anal. Chem.， 2013， 45： 182-196

2DING MingYu， ZHENG Rui， PENG Hong. Chinese J. Anal. Chem.， 2009， 37（3）： 395-398

3Fan Y， Feng Y， Zhang J. Da S， Zhang M. J. Chromatogr. A， 2005， 1074（12）： 9-16

4Potter O G， Hilder E F. J. Sep. Sci.， 2008， 31（11）： 1881-1906

5Wu S， Sun L， Ma J， Yang K， Liang Z， Zhang L， Zhang Y. Talanta， 2011， 83（5）： 1748-1753

6Spro J， Sinz A. Anal. Bioanal. Chem.， 2012， 402（7）： 2395-2405

7Ma Z， Guan Y， Liu H. J. Magn. Magn. Mater.， 2006， 301（2）： 469-477

8Ali M， Nasir S， Nguyen Q H， Sahoo J K， Tahir M N， Tremel W， Ensinger W. J. Am. Chem. Soc.， 2011， 133（43）： 17307-17314

9Wang Q， Guan Y， Yang M. J. Magn. Magn. Mater.， 2012， 324（20）： 3300-3305

10Gu J， Codd R. J. Inorg. Biochem.， 2012， 115： 198-203

11YE FangGui， HAN YanYan， WANG Shun， HUANG BaoJun， ZHAO ShuLin. Chinese J. Anal. Chem.， 2010， 38（2）： 192-196

12ZHANG AiZhu， YE FangGui， LU JunYu， WEI Zong， PENG Yan， ZHAO ShuLin. Chinese J. Anal. Chem.， 2011， 39（8）： 1247-1250

13Zhang M， Wei F， Zhang Y， Nie J， Feng Y. J. Chromatogr. A， 2006， 1102（12）： 294-301