发酵液中L—赤藓酮糖的紫外法测定

刘宇鹏+潘龙+郑小娟+靳魁奇+安珊珊

摘要：采用紫外法测定发酵液中的L-赤藓酮糖。以谢里瓦诺夫（Seliwanoff）试剂为显色剂，考察了显色剂用量、反应温度、反应时间和显色稳定时间等因素，确定了优化后的试验条件。紫外法的线性范围为0～1.2 g/L，样品回收率为101.5%～101.9%，测定结果不受发酵液中底物及菌体自溶物影响，具有快速准确的优点。

关键词：L-赤藓酮糖；Seliwanoff试剂；分光光度法；紫外法测定

中图分类号：TQ920.1；O657.32 文献标志码：A

文章编号：1002-1302（2014）08-0281-03

L-赤藓酮糖（L-erythrulose）^[1]是一种自然存在的四碳酮醣，是一种黏稠状液体，可溶于水，其醛糖形式是L-赤藓糖，L-赤藓酮糖可以与皮肤外部或者老死表层中的角蛋白氨基酸（即表皮的角质层）发生反应，在化妆品工业中作为二羟基丙酮^[2]的替代品，解决了大多数人群对二羟基丙酮过敏的问题，同时是多种抗感染药物的前体化合物^[3]。传统生产L-赤藓酮糖的方法是以赤藓糖醇（meso-erythritol）^[4]为前体的化学合成法，但此法比较繁琐，且产物为消旋体手性化合物，拆分困难。微生物转化法通过发酵过程中的酶促反应，可选择性生成L型产物，且该法操作简便，绿色环保，能够解决化学合成法带来的一系列问题^[5]。因此以赤藓糖醇作为底物，通过微生物发酵转化生产L-赤藓酮糖逐渐引起人们的关注。据报道，发酵液中L-赤藓酮糖的检测方法有HPLC法^[6]、薄层色谱法^[7]和容量分析法^[8]等，其中薄层色谱法只能定性分析，无法精确定量；容量分析法的测定受发酵液中其他物质的影响，无法精确测定L-赤藓酮糖；HPLC法则较为耗时。据报道，在酸性条件下发酵液中酮糖脱水生成糠醛，后者与谢里瓦诺夫（Seliwanoff）试剂反应生成红色复合物^[3]。本研究表明，L-赤藓酮糖在酸性条件下也能与Seliwanoff试剂生成棕红色复合物，该复合物在400 nm处的吸光度与L-赤藓酮糖浓度的线性关系良好；而底物赤藓糖醇在此条件下不干扰测定。本研究根据这一原理，建立了紫外法测定发酵液中的L-赤藓酮糖，方法准确、简便、灵敏。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

UV-1750型紫外-可见光分光光度计，日本Shimadzu公司；752N型紫外可见分光光度计，上海仪电分析仪器有限公司；1515型高效液相色谱仪，美国Waters公司。

L-赤藓酮糖（美国Sigma公司）；间苯二酚、浓盐酸、蛋白胨和磷酸二氢钾均为分析纯；酵母粉为生化试剂；水为蒸馏水。

试验菌种为氧化葡萄糖酸杆菌（Gluconobacter oxydans 1.637），购自中国普通微生物菌种保藏管理中心。

发酵培养基配方为：赤藓糖醇5%，蛋白胨0.5%，酵母粉1%，无水磷酸二氢钾0.1%，碳酸钙0.3%，pH值6.8。

1.2 试验方法

1.2.1 溶液配制 L-赤藓酮糖溶液：精确称取2g L-赤藓酮糖置于1 000 mL量瓶中，用水定容，制成2g/L的母液，再分别用水稀释成0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 g/L的梯度浓度溶液。

Seliwanoff试剂：称取2 g间苯二酚溶于330mL浓盐酸中，加水定容至1 000 mL，完全溶解后密封保存。

1.2.2 紫外法测定L-赤藓酮糖 分别量取0.5mL L-赤藓酮糖系列浓度溶液和4 mL Seliwanoff试剂于比色管中，沸水浴加热20 min，流水冷却；以不含L-赤藓酮糖的溶液为空白参比，测定样品的吸光度D400 nm。

发酵液中L-赤藓酮糖的测定：取对数期种子液，按5%接种量接入250 mL摇瓶中，装液量30 mL，调节pH值为6.8，于30 ℃振荡（220 r/min）培养28 h，取1.5 mL发酵液，离心（3 500 r/min）15 min；取0.5 mL上清液，用水稀释100倍，取0.5 mL稀释液，再加入4 mL Seliwanoff试剂，沸水浴加热 20 min，流水冷却；以未接种发酵液为空白参照，于400 nm处测吸光度D400 nm，根据标准曲线计算发酵液中L-赤藓酮糖的含量。

1.2.3 HPLC法测定L-赤藓酮糖条件^[6]色谱柱 Agilent Lichrospher5-NH2柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；检测波长 277 nm；流动相 乙腈-水（90 ∶10）；柱温 30 ℃；流速 1 mL/min；进样量 20 μL。

1.2.4 赤藓糖醇浓度的测定 用HPLC法^[6]测定发酵液中的赤藓糖醇。

2 结果与分析

2.1 试验条件的确定

2.1.1 波长的测定 按照“1.2.2”中的方法，以水为空白对照，扫描不同浓度L-赤藓酮糖在370～700 nm的吸收光谱。每个样品重复测定3次。保持Seliwanoff试剂浓度不变，仅改变L-赤藓酮糖的浓度（0.1～1.2 g/L），所得系列吸收光谱见图1。由图1可以看出，在400 nm波长处反应溶液有最大吸收，且吸光度的增加与L-赤藓酮糖溶液浓度的增加成正比。最终选择测定波长为400 nm。

3 结论

本研究建立了紫外法测定以赤藓糖醇为底物的发酵液中的L-赤藓酮糖。结果显示，L-赤藓酮糖浓度超过1.2 g/L后D400 nm大于0.6，因此拟定本法的线性范围为0.1～1.2 g/L。配制Seliwanoff试剂的溶剂为浓盐酸与间苯二酚，易挥发，加热过程中要注意保持密封。经对比试验，HPLC法和紫外法的测量误差在2%以内，且本法不受发酵液中赤藓糖醇和可溶性蛋白的影响，显色稳定，测量快速准确，适合用于微生物发酵法制备L-赤藓酮糖工艺中的产物测定。

参考文献：

[1]Bongs J，Hahn D，Schrken U，et al. Continuous production of erythrulose using transketolase in a membrane reactor[J]. Biotechnology Letters，1997，19（3）：213-216.

[2]Douschan K. Process for the biotechnological preparation of L-erythrulose：WO，01/42483 A1[P].2011-06-14.

[3]张惟杰. 糖复合物生化研究技术[M]. 杭州：浙江大学出版社，1999：540.

[4]张永勤，薛长湖，汤浩源，等. 还原糖的可见分光光度法研究进展[J]. 食品与发酵工业，2007，33（5）：97-99，104.

[5]Sprenger G A，Schrken U，Sprenger G，et al.Transketolase a of Escherichia coli K12[J]. European Journal of Biochemistry，1995，230（2）：525-532.

[6]葛驰宇，张君丽，陈建华. 高效液相色谱法同时测定发酵液中赤藓糖醇和L-赤藓酮糖的含量[J]. 色谱，2012，30（8）：843-846.

[7]张永勤，王哲平，宋雨梅，等. 还原糖测定方法的比较研究[J]. 食品工业科技，2010，31（6）：321-323，326.

[8]魏 群. 基础生物化学实验[M]. 3版.北京：高等教育出版社，2009：81-82.

[9]刘宇鹏，李 华，孙 杨，等. 发酵液中1，3-二羟基丙酮的分光光度法测定[J]. 中国医药工业杂志，2011，42（11）：834-837.endprint

摘要：采用紫外法测定发酵液中的L-赤藓酮糖。以谢里瓦诺夫（Seliwanoff）试剂为显色剂，考察了显色剂用量、反应温度、反应时间和显色稳定时间等因素，确定了优化后的试验条件。紫外法的线性范围为0～1.2 g/L，样品回收率为101.5%～101.9%，测定结果不受发酵液中底物及菌体自溶物影响，具有快速准确的优点。

关键词：L-赤藓酮糖；Seliwanoff试剂；分光光度法；紫外法测定

中图分类号：TQ920.1；O657.32 文献标志码：A

文章编号：1002-1302（2014）08-0281-03

L-赤藓酮糖（L-erythrulose）^[1]是一种自然存在的四碳酮醣，是一种黏稠状液体，可溶于水，其醛糖形式是L-赤藓糖，L-赤藓酮糖可以与皮肤外部或者老死表层中的角蛋白氨基酸（即表皮的角质层）发生反应，在化妆品工业中作为二羟基丙酮^[2]的替代品，解决了大多数人群对二羟基丙酮过敏的问题，同时是多种抗感染药物的前体化合物^[3]。传统生产L-赤藓酮糖的方法是以赤藓糖醇（meso-erythritol）^[4]为前体的化学合成法，但此法比较繁琐，且产物为消旋体手性化合物，拆分困难。微生物转化法通过发酵过程中的酶促反应，可选择性生成L型产物，且该法操作简便，绿色环保，能够解决化学合成法带来的一系列问题^[5]。因此以赤藓糖醇作为底物，通过微生物发酵转化生产L-赤藓酮糖逐渐引起人们的关注。据报道，发酵液中L-赤藓酮糖的检测方法有HPLC法^[6]、薄层色谱法^[7]和容量分析法^[8]等，其中薄层色谱法只能定性分析，无法精确定量；容量分析法的测定受发酵液中其他物质的影响，无法精确测定L-赤藓酮糖；HPLC法则较为耗时。据报道，在酸性条件下发酵液中酮糖脱水生成糠醛，后者与谢里瓦诺夫（Seliwanoff）试剂反应生成红色复合物^[3]。本研究表明，L-赤藓酮糖在酸性条件下也能与Seliwanoff试剂生成棕红色复合物，该复合物在400 nm处的吸光度与L-赤藓酮糖浓度的线性关系良好；而底物赤藓糖醇在此条件下不干扰测定。本研究根据这一原理，建立了紫外法测定发酵液中的L-赤藓酮糖，方法准确、简便、灵敏。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

UV-1750型紫外-可见光分光光度计，日本Shimadzu公司；752N型紫外可见分光光度计，上海仪电分析仪器有限公司；1515型高效液相色谱仪，美国Waters公司。

L-赤藓酮糖（美国Sigma公司）；间苯二酚、浓盐酸、蛋白胨和磷酸二氢钾均为分析纯；酵母粉为生化试剂；水为蒸馏水。

试验菌种为氧化葡萄糖酸杆菌（Gluconobacter oxydans 1.637），购自中国普通微生物菌种保藏管理中心。

发酵培养基配方为：赤藓糖醇5%，蛋白胨0.5%，酵母粉1%，无水磷酸二氢钾0.1%，碳酸钙0.3%，pH值6.8。

1.2 试验方法

1.2.1 溶液配制 L-赤藓酮糖溶液：精确称取2g L-赤藓酮糖置于1 000 mL量瓶中，用水定容，制成2g/L的母液，再分别用水稀释成0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 g/L的梯度浓度溶液。

Seliwanoff试剂：称取2 g间苯二酚溶于330mL浓盐酸中，加水定容至1 000 mL，完全溶解后密封保存。

1.2.2 紫外法测定L-赤藓酮糖 分别量取0.5mL L-赤藓酮糖系列浓度溶液和4 mL Seliwanoff试剂于比色管中，沸水浴加热20 min，流水冷却；以不含L-赤藓酮糖的溶液为空白参比，测定样品的吸光度D400 nm。

发酵液中L-赤藓酮糖的测定：取对数期种子液，按5%接种量接入250 mL摇瓶中，装液量30 mL，调节pH值为6.8，于30 ℃振荡（220 r/min）培养28 h，取1.5 mL发酵液，离心（3 500 r/min）15 min；取0.5 mL上清液，用水稀释100倍，取0.5 mL稀释液，再加入4 mL Seliwanoff试剂，沸水浴加热 20 min，流水冷却；以未接种发酵液为空白参照，于400 nm处测吸光度D400 nm，根据标准曲线计算发酵液中L-赤藓酮糖的含量。

1.2.3 HPLC法测定L-赤藓酮糖条件^[6]色谱柱 Agilent Lichrospher5-NH2柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；检测波长 277 nm；流动相 乙腈-水（90 ∶10）；柱温 30 ℃；流速 1 mL/min；进样量 20 μL。

1.2.4 赤藓糖醇浓度的测定 用HPLC法^[6]测定发酵液中的赤藓糖醇。

2 结果与分析

2.1 试验条件的确定

2.1.1 波长的测定 按照“1.2.2”中的方法，以水为空白对照，扫描不同浓度L-赤藓酮糖在370～700 nm的吸收光谱。每个样品重复测定3次。保持Seliwanoff试剂浓度不变，仅改变L-赤藓酮糖的浓度（0.1～1.2 g/L），所得系列吸收光谱见图1。由图1可以看出，在400 nm波长处反应溶液有最大吸收，且吸光度的增加与L-赤藓酮糖溶液浓度的增加成正比。最终选择测定波长为400 nm。

3 结论

本研究建立了紫外法测定以赤藓糖醇为底物的发酵液中的L-赤藓酮糖。结果显示，L-赤藓酮糖浓度超过1.2 g/L后D400 nm大于0.6，因此拟定本法的线性范围为0.1～1.2 g/L。配制Seliwanoff试剂的溶剂为浓盐酸与间苯二酚，易挥发，加热过程中要注意保持密封。经对比试验，HPLC法和紫外法的测量误差在2%以内，且本法不受发酵液中赤藓糖醇和可溶性蛋白的影响，显色稳定，测量快速准确，适合用于微生物发酵法制备L-赤藓酮糖工艺中的产物测定。

参考文献：

[1]Bongs J，Hahn D，Schrken U，et al. Continuous production of erythrulose using transketolase in a membrane reactor[J]. Biotechnology Letters，1997，19（3）：213-216.

[2]Douschan K. Process for the biotechnological preparation of L-erythrulose：WO，01/42483 A1[P].2011-06-14.

[3]张惟杰. 糖复合物生化研究技术[M]. 杭州：浙江大学出版社，1999：540.

[4]张永勤，薛长湖，汤浩源，等. 还原糖的可见分光光度法研究进展[J]. 食品与发酵工业，2007，33（5）：97-99，104.

[5]Sprenger G A，Schrken U，Sprenger G，et al.Transketolase a of Escherichia coli K12[J]. European Journal of Biochemistry，1995，230（2）：525-532.

[6]葛驰宇，张君丽，陈建华. 高效液相色谱法同时测定发酵液中赤藓糖醇和L-赤藓酮糖的含量[J]. 色谱，2012，30（8）：843-846.

[7]张永勤，王哲平，宋雨梅，等. 还原糖测定方法的比较研究[J]. 食品工业科技，2010，31（6）：321-323，326.

[8]魏 群. 基础生物化学实验[M]. 3版.北京：高等教育出版社，2009：81-82.

[9]刘宇鹏，李 华，孙 杨，等. 发酵液中1，3-二羟基丙酮的分光光度法测定[J]. 中国医药工业杂志，2011，42（11）：834-837.endprint

摘要：采用紫外法测定发酵液中的L-赤藓酮糖。以谢里瓦诺夫（Seliwanoff）试剂为显色剂，考察了显色剂用量、反应温度、反应时间和显色稳定时间等因素，确定了优化后的试验条件。紫外法的线性范围为0～1.2 g/L，样品回收率为101.5%～101.9%，测定结果不受发酵液中底物及菌体自溶物影响，具有快速准确的优点。

关键词：L-赤藓酮糖；Seliwanoff试剂；分光光度法；紫外法测定

中图分类号：TQ920.1；O657.32 文献标志码：A

文章编号：1002-1302（2014）08-0281-03

L-赤藓酮糖（L-erythrulose）^[1]是一种自然存在的四碳酮醣，是一种黏稠状液体，可溶于水，其醛糖形式是L-赤藓糖，L-赤藓酮糖可以与皮肤外部或者老死表层中的角蛋白氨基酸（即表皮的角质层）发生反应，在化妆品工业中作为二羟基丙酮^[2]的替代品，解决了大多数人群对二羟基丙酮过敏的问题，同时是多种抗感染药物的前体化合物^[3]。传统生产L-赤藓酮糖的方法是以赤藓糖醇（meso-erythritol）^[4]为前体的化学合成法，但此法比较繁琐，且产物为消旋体手性化合物，拆分困难。微生物转化法通过发酵过程中的酶促反应，可选择性生成L型产物，且该法操作简便，绿色环保，能够解决化学合成法带来的一系列问题^[5]。因此以赤藓糖醇作为底物，通过微生物发酵转化生产L-赤藓酮糖逐渐引起人们的关注。据报道，发酵液中L-赤藓酮糖的检测方法有HPLC法^[6]、薄层色谱法^[7]和容量分析法^[8]等，其中薄层色谱法只能定性分析，无法精确定量；容量分析法的测定受发酵液中其他物质的影响，无法精确测定L-赤藓酮糖；HPLC法则较为耗时。据报道，在酸性条件下发酵液中酮糖脱水生成糠醛，后者与谢里瓦诺夫（Seliwanoff）试剂反应生成红色复合物^[3]。本研究表明，L-赤藓酮糖在酸性条件下也能与Seliwanoff试剂生成棕红色复合物，该复合物在400 nm处的吸光度与L-赤藓酮糖浓度的线性关系良好；而底物赤藓糖醇在此条件下不干扰测定。本研究根据这一原理，建立了紫外法测定发酵液中的L-赤藓酮糖，方法准确、简便、灵敏。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

UV-1750型紫外-可见光分光光度计，日本Shimadzu公司；752N型紫外可见分光光度计，上海仪电分析仪器有限公司；1515型高效液相色谱仪，美国Waters公司。

L-赤藓酮糖（美国Sigma公司）；间苯二酚、浓盐酸、蛋白胨和磷酸二氢钾均为分析纯；酵母粉为生化试剂；水为蒸馏水。

试验菌种为氧化葡萄糖酸杆菌（Gluconobacter oxydans 1.637），购自中国普通微生物菌种保藏管理中心。

发酵培养基配方为：赤藓糖醇5%，蛋白胨0.5%，酵母粉1%，无水磷酸二氢钾0.1%，碳酸钙0.3%，pH值6.8。

1.2 试验方法

1.2.1 溶液配制 L-赤藓酮糖溶液：精确称取2g L-赤藓酮糖置于1 000 mL量瓶中，用水定容，制成2g/L的母液，再分别用水稀释成0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 g/L的梯度浓度溶液。

Seliwanoff试剂：称取2 g间苯二酚溶于330mL浓盐酸中，加水定容至1 000 mL，完全溶解后密封保存。

1.2.2 紫外法测定L-赤藓酮糖 分别量取0.5mL L-赤藓酮糖系列浓度溶液和4 mL Seliwanoff试剂于比色管中，沸水浴加热20 min，流水冷却；以不含L-赤藓酮糖的溶液为空白参比，测定样品的吸光度D400 nm。

发酵液中L-赤藓酮糖的测定：取对数期种子液，按5%接种量接入250 mL摇瓶中，装液量30 mL，调节pH值为6.8，于30 ℃振荡（220 r/min）培养28 h，取1.5 mL发酵液，离心（3 500 r/min）15 min；取0.5 mL上清液，用水稀释100倍，取0.5 mL稀释液，再加入4 mL Seliwanoff试剂，沸水浴加热 20 min，流水冷却；以未接种发酵液为空白参照，于400 nm处测吸光度D400 nm，根据标准曲线计算发酵液中L-赤藓酮糖的含量。

1.2.3 HPLC法测定L-赤藓酮糖条件^[6]色谱柱 Agilent Lichrospher5-NH2柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；检测波长 277 nm；流动相 乙腈-水（90 ∶10）；柱温 30 ℃；流速 1 mL/min；进样量 20 μL。

1.2.4 赤藓糖醇浓度的测定 用HPLC法^[6]测定发酵液中的赤藓糖醇。

2 结果与分析

2.1 试验条件的确定

2.1.1 波长的测定 按照“1.2.2”中的方法，以水为空白对照，扫描不同浓度L-赤藓酮糖在370～700 nm的吸收光谱。每个样品重复测定3次。保持Seliwanoff试剂浓度不变，仅改变L-赤藓酮糖的浓度（0.1～1.2 g/L），所得系列吸收光谱见图1。由图1可以看出，在400 nm波长处反应溶液有最大吸收，且吸光度的增加与L-赤藓酮糖溶液浓度的增加成正比。最终选择测定波长为400 nm。

3 结论

本研究建立了紫外法测定以赤藓糖醇为底物的发酵液中的L-赤藓酮糖。结果显示，L-赤藓酮糖浓度超过1.2 g/L后D400 nm大于0.6，因此拟定本法的线性范围为0.1～1.2 g/L。配制Seliwanoff试剂的溶剂为浓盐酸与间苯二酚，易挥发，加热过程中要注意保持密封。经对比试验，HPLC法和紫外法的测量误差在2%以内，且本法不受发酵液中赤藓糖醇和可溶性蛋白的影响，显色稳定，测量快速准确，适合用于微生物发酵法制备L-赤藓酮糖工艺中的产物测定。

参考文献：

[1]Bongs J，Hahn D，Schrken U，et al. Continuous production of erythrulose using transketolase in a membrane reactor[J]. Biotechnology Letters，1997，19（3）：213-216.

[2]Douschan K. Process for the biotechnological preparation of L-erythrulose：WO，01/42483 A1[P].2011-06-14.

[3]张惟杰. 糖复合物生化研究技术[M]. 杭州：浙江大学出版社，1999：540.

[4]张永勤，薛长湖，汤浩源，等. 还原糖的可见分光光度法研究进展[J]. 食品与发酵工业，2007，33（5）：97-99，104.

[5]Sprenger G A，Schrken U，Sprenger G，et al.Transketolase a of Escherichia coli K12[J]. European Journal of Biochemistry，1995，230（2）：525-532.

[6]葛驰宇，张君丽，陈建华. 高效液相色谱法同时测定发酵液中赤藓糖醇和L-赤藓酮糖的含量[J]. 色谱，2012，30（8）：843-846.

[7]张永勤，王哲平，宋雨梅，等. 还原糖测定方法的比较研究[J]. 食品工业科技，2010，31（6）：321-323，326.

[8]魏 群. 基础生物化学实验[M]. 3版.北京：高等教育出版社，2009：81-82.

[9]刘宇鹏，李 华，孙 杨，等. 发酵液中1，3-二羟基丙酮的分光光度法测定[J]. 中国医药工业杂志，2011，42（11）：834-837.endprint