DREB转录因子及其在植物抗逆育种中的应用进展

2014-10-23牛伟博

江苏农业科学 2014年8期

牛伟博

摘要：DREB（干旱应答元件结合蛋白）转录因子是AP2/EREBP的一个亚族。由于其过量表达能够提高植物抗旱、耐盐、耐低温、抗冻甚至抵抗重金属等逆境胁迫的能力，因此DREB转录因子基因被作为应用基因工程途径进行植物抗逆性状改良的理想候选基因。本文主要综述了DREB转录因子的结构、功能以及近年来国内外新的DREB转录因子基因的发现及其在培育抗逆性转基因植物中的应用，以期为植物抗逆分子育种改良提供参考。

关键词：DREB；转录因子；逆境胁迫；转基因植物

中图分类号：Q943.2 文献标志码：A

文章编号：1002-1302（2014）08-0017-04

干旱、低温、高盐等非生物逆境胁迫是农业、林业、草业生产中严重的自然灾害，世界每年因此造成巨大损失。这些非生物逆境胁迫能够引起植物一系列的相关响应，比如响应不同胁迫导致一些转录因子的表达，进而调节相关下游基因的大量表达，通过操纵转录因子的表达去提高植物应对逆境胁迫的能力^[1]。因此，为了解决粮食危机，改善生态环境，植物基因工程被广泛应用到农作物以及森林树木，实现了农作物和林木的优质高产，改良其经济性状，加速优良新品种的培育^[2-3]。

转录因子（transcription factor，TF），又称反式作用因子，是一群能与真核基因启动子区域中的顺式作用元件发生特异性结合，从而保证目的基因以特定的强度在特定的时间与空间表达的DNA结合蛋白质。当植物受到逆境胁迫时，细胞膜上具有各种不同信号的受体分子（其中包括感受水分、温度、盐度的受体分子），这些受体分子感知逆境信号后，使逆境信号沿着“膜蛋白受体-IP3（1，4，5-肌醇三磷酸）、Ca2+等第二信使分子-蛋白激酶-转录因子-抗逆基因”途径在植物细胞内逐级传递^[4]。与逆境相关、编码产物参与信号传递途径和基因表达调控过程的转录因子主要包括五个家族：MYB（v-myb avian myeloblastosis viral oncogene homolog）、bZIP（basic leucine zipper）、WRKY（因含有高度保守的核心氨基酸序列WRKYGQK而命名）、AP2/EREBP（APETALA2/ethylene-responsive element binding proteins）和NAC（因其N端为保守的大约150个氨基酸NAC结构域命名）^[5]。其中，DREB（dehydration responsive element binding protein，干旱应答元件结合蛋白）转录因子是AP2/EREBP的一个亚族，主要功能是调节植物对逆境胁迫等的应答反应。

DREB转录因子作为干旱、低温、高盐胁迫应答的主要成分，可与下游基因启动子中的CRT/DRE（C-repeat/dehydration responsive element）顺式作用元件相结合，调节一系列依赖该顺式作用元件的抗逆功能基因的表达，进而引起脯氨酸、可溶性糖、叶绿素等含量的提高，从而增强植物对于干旱、低温以及高盐等逆境的抗性^[2]。本文主要综述DREB转录因子的结构、功能，以及近几年来国内外对DREB转录因子的研究进展，并对DREB转录因子在农业、林业、草业培育抗逆转基因植物中的应用进行概括。

1 DREB转录因子

1.1 DREB转录因子的结构

自1997年Stockinger^[6]首次从拟南芥cDNA文库中分离到编码DREB蛋白的CBF1基因以来，已经从各种草本植物中克隆出大量的DREB类基因，近年来，又在木本植物相继克隆出DREB类基因。目前从NCBI（National Center for Biotechnology Information）上可以检索到的DREB基因的mRNA 共有368条。从蛋白质结构分析，DREB转录因子一般由4个独立功能区域组成，包括：（1）DNA 结合域（DNA binding domain）；（2）转录调节区（transcription regulation domain）；（3）核定位信号区（nuclear localization signal，NLS）；（4）寡聚化位点（oligomerization domain）。

DREB转录因子家族中的AP2结构域高度保守，而N端和C端的相似性比较低。AP2结构域由60个氨基酸组成，有VRG和RAYD两个保守区。VRG含有20个氨基酸，大多为碱性氨基酸，有助于和DNA的结合；RAYD由40个氨基酸组成，其可以通过影响VRG 区的构象或通过与其他蛋白的相互作用来调节AP2结构域与DNA 的结合。AP2结构域的第14位为缬氨酸（Valine，V），第19位为谷氨酸（Glutamic，E），这两个位点非常保守，是与DRE作用元件相互结合的关键位点^[7]。DREB转录因子的二级结构具有典型的结构特征：碱性氨基酸富集于N端，是核定为信号区；而酸性氨基酸富集于C端，为转录激活区。

1.2 DREB转录因子的功能

近年来通过对DREB类转录因子功能的深入研究，发现DREB在干旱胁迫等逆境环境下具有重要作用，同时一个转录因子可以调控多个与抗逆性有关基因的表达，这相对于单纯使用下游某种单一功能基因来改变植物的抗逆能力具有显著的优点。从表1可以看出，不同植物克隆到的DREB基因在逆境下的表达特性主要集中在抗旱、耐低温、抗冻和耐盐等方面，甚至还具有抗Na2CO3、NaHCO3以及重金属^[8]（铜、镉）等能力，表明DREB基因主要参与植物对逆境胁迫的应答。

2 DREB转录因子在培育抗逆性转基因植物中的应用

与传统的植物育种方法相比，基因工程技术具有时间短、效率高、提高植物抗逆性强等优点。同时，DREB类转录因子在植物逆境胁迫中发挥着重要作用。DREB类转录因子基因的表达可以同时调控下游多个相关抗逆基因的表达，使植物抵抗逆境环境的综合能力得到提高。自从拟南芥CBF1基因^[6]发现之后，大量的DREB基因首先从草本植物中被分离和鉴定，并且在草本植物抗逆性转化中得到了普遍应用。由于木本植物寿命长、体型高大等特点，为了抵御外界不同自然环境的侵害，形成了比草本植物更为复杂的抗逆分子机制。但随着近年来分子生物学技术的进一步发展，越来越多的DREB类转录因子基因同样从木本植物中筛选出来并进一步得到转化植株。

2.1 DREB转录因子基因在农业中的应用

在农作物中发现的DREB类转录因子基因很多，谢登雷等^[25]利用电子克隆和 RT-PCR 方法从高粱（Sorghum bicolor）中克隆到SbDREB2基因，通过氨基酸序列分析，该基因编码的蛋白在 82～145 区含有DREB类转录因子家族特有的AP2保守结构域，与玉米DREB2A、水稻 DREB1蛋白相似度分别为 84%和69%。Real-time PCR分析结果显示， SbDREB2 基因在高粱根、茎、叶中均能表达，并且在根中的表达量为茎中表达量的2.5倍，属于组成型表达。受干旱、高盐以及脱落酸（abscisic acid，ABA）的强烈诱导，但几乎不受低温的影响。Lucas等^[26]在野生二粒小麦（Triticum dicoccoides）中克隆得到TdicDRF1基因，Real-time PCR 表达特征性显示，在干旱胁迫条件下，该基因在小麦根中的表达量显著增加，然而在叶中的表达量几乎没有变化，说明了该基因的组织特异性表达。刘晓颖等^[27]从白菜（Brassica pekinensis）中分离得到BpDREB1基因，进化树分析结果表明，BpDREB1属于DREB 亚家族中A1亚族，该基因受低温、干旱诱导表达，但几乎不受高盐处理的影响，拟南芥经低温诱导后，过量表达BpDREB1 基因，体内的可溶性糖和脯氨酸含量显著升高，以更好地适应胁迫环境。

DREB基因在农业育种中的应用普遍，利用OsDREB2A基因提高水稻（Oryza sativa）TNG67的抗性，在诱导型启动子4ABRC的作用下，分别通过干旱胁迫和盐胁迫，结果显示，转基因水稻的存活率明显高于非转基因水稻和转空载体的水稻，并且OsDREB2A受ABA的强烈诱导^[19]，说明OsDREB2A基因在逆境条件下保护水稻细胞。周永斌等^[28]研究了不同干旱胁迫下转W16基因（一种DREB类基因）小麦基因表达特性及其抗旱机制，通过RT-PCR结果显示，在正常灌溉条件下，W16基因在野生型小麦中有微弱表达，随着胁迫增强，表达量增加，在干旱胁迫12 h 表达量达到峰值，接着随着胁迫加剧，表达量下降，呈“上升—峰值—下降”的特点，而转W16基因小麦在Ubiquitin 启动子作用下，W16基因表达恒定且维持在较高的水平；抗性生理生化分析结果表明，在不同的干旱胁迫条件下，转基因植株的叶绿素含量、脯氨酸含量、可溶性糖含量、水分利用效率的变化均高于受体对照，尤其在重度干旱胁迫下更加高于受体对照。DREB类转录因子基因也在大麦^[12]、番茄^[15]、马铃薯^[16]、烟草^[23]等农作物育种中得到应用。

2.2 DREB转录因子基因在林业中的应用

近年来，DREB类转录因子基因在林木中被相继分离和鉴定，成为DREB类转录因子的一个研究热点。翟俊峰等^[29]首次从银中杨（Populus albaxp）中克隆得到PaDREB基因，Real-time PCR检测结果显示，干旱、高盐、低温以及ABA均能诱导PaDREB基因的表达。并且经过同源性比较和系统发育分析证实该基因与月季DREB2C基因具有较高的同源性。陈金焕等^[30]从胡杨（Populus euphratica）中分离得到PeDREB3和PeDREB4 2个编码DREB类蛋白的基因，这2个基因在胡杨的根、茎、叶中均有表达。序列分析结果显示，PeDREB3和PeDREB4含有非典型的AP2/ERF结构域，并且利用改进的酵母单杂交技术发现其能够在酵母中激活下游报告基因的表达。Tang等^[20]从麻风树（Jatropha curcas）分离得到JcDREB基因，通过序列分析和酵母单杂交显示，JcDREB属于DREB类转录因子A6亚族基因。通过Real-time PCR检测结果显示，干旱、高盐、低温均能诱导JcDREB基因的表达，而不受ABA的诱导。在拟南芥中过量表达JcDREB基因能够显著提高拟南芥的耐盐和抗冻性。

目前DREB类转录因子已经在林木育种中得到应用。杨春霞等^[31]以美洲黑杨杂种（Populus×Euramericana cv.）优良无性系南林895杨为转基因受体材料，利用农杆菌GV3101介导法转化DREB1C基因，得到转基因抗性植株。通过抗性试验，结果显示，转基因植株的抗旱、耐盐性能均高于非转基因植株。 Li等[2，18]利用FaDREB1、FaDREB2基因提高构树抵抗逆境的能力。在CaMV35S（cauliflower mosaic virus 35S）启动子的诱导下，和野生型植株相比，转FaDREB1、FaDREB2基因构树具有更强的抵御干旱和盐害的能力。在干旱胁迫13 d或者250 mmol/L NaCl处理15 d，所有的野生型植株死亡，然而过量表达FaDREB1、FaDREB2基因的转基因植株存活了下来。转基因构树在干旱处理和高盐处理条件下，其叶片含水量、叶绿素含量、脯氨酸含量以及可溶性糖含量的积累均高于野生构树，说明转基因植株具有更好的抗性。并且在正常的生长条件下，CaMV35S启动子并没有引起植株生长的延滞和矮化。目前DREB类转录因子基因也在苹果^[22]、胡杨^[24]等林木育种中得到应用。

2.3 DREB转录因子基因在草业中的应用

谢健等^[32]从紫花苜蓿（Medicago sativa L.）中分离得到DREB1 转录因子基因，分别对其编码蛋白的理化性质、二级结构和三级结构进行了分析，结果显示，紫花苜蓿共编码218个氨基酸，该蛋白质属于AP2家族，为亲水蛋白且没有信号肽。Peng等^[21]基于羊草（Leymus chinensis）的高通量测序结果，克隆得到一个新的基因LcDREB3a，受干旱、高盐和ABA的诱导。并且通过将LcDREB3a转入拟南芥验证该基因的功能，结果显示，和非转基因拟南芥相比，过量表达LcDREB3a基因并没有引起植株生长延滞，并且转基因植株具有更强的抵抗干旱和盐害的能力，该基因能够提高植物适应逆境的能力。Wang等^[23]采用RACE技术从柠条（Caragana korshinskii）中分离到CkDREB基因，该基因全长1 743 bp，编码345个氨基酸，干旱、高盐、低温均能诱导该基因的表达，外源性的ABA也能提高CkDREB基因的表达。通过在烟草中过量表达该基因，在正常条件下能够显著提高烟草的抗盐和抵抗渗透胁迫的能力，并且能够诱导下游目标基因的表达，这些结果说明CkDREB基因在柠条抗逆中发挥着至关重要的作用。

目前，也有关于DREB转录因子在牧草育种中应用的报道。 Zhou等^[17]利用农杆菌介导得到转PeDREB2a基因百脉根（Lotus corniculatus）植株，干旱和低盐条件均引起转基因植株和野生型植株的生长延滞，但是对野生型植株来说这种生长延滞更为明显，说明过量表达PeDREB2a基因能够提高百脉根抵抗干旱和低盐的能力。同时DREB转录因子基因也在结缕草^[33]、狼尾草^[34]等牧草中得到应用。

3 展望

DREB类转录因子在植物逆境信号转导中占据着重要的位置。国内外已对DREB转录因子的结构，在逆境胁迫下的信号转导途径以及培育转基因抗逆植物进行了大量研究。通过揭示DREB转录因子在植物逆境胁迫应答过程中的作用机制，导入或者改良转录因子来调节下游多个抗逆功能基因综合发挥作用，进而达到提高植物抵抗逆境的能力。但目前仍然存在着许多问题有待进一步研究，如植物的抗逆性是许多基因相互叠加的综合效果，形成了极为复杂的基因表达调控网络，这些调控网络结构有待进一步深入研究。DREB转录因子基因作为提高植物响应干旱、高盐、低温的重要候选基因，近期又有报道一些DREB基因能够增强植物的耐热性^[35-36]和抵御重金属的能力，因此分离和鉴定更多的、新的DREB基因是非常有用的，这对于深入研究植物的抗逆机制以及进行抗逆农作物、林木、牧草新品种的培育具有重要意义。

参考文献：

[1]Xu Z S，Chen M，Li L C，et al. Functions and application of the AP2/ERF transcription factor family in crop improvement[J]. Journal of Integrative Plant Biology，2011，53（7）：570-585.

[2]Li M R，Li Y，Li H Q，et al. Ectopic expression of FaDREB2 enhances osmotic tolerance in paper mulberry[J]. Journal of Integrative Plant Biology，2011，53（12）：951-960.

[3]Mallikarjuna G，Mallikarjuna K，Reddy M K，et al. Expression of OsDREB2A transcription factor confers enhanced dehydration and salt stress tolerance in rice（Oryza sativa L.）[J]. Biotechnology Letters，2011，33（8）：1689-1697.

[4]刘杰，马欣，董凤丽，等. DREB/CBF基因响应植物抗冷途径的研究进展[J]. 林业科技，2013，38（3）：34-39.

[5]姚晓华. 植物抗寒相关功能与调控基因研究进展[J]. 中国农学通报，2013，29（27）：141-147.

[6]Stockinger E J，Gilmour S J，Thomashow M F. Arabidopsis thaliana CBF1 encodes an AP2 domain-containing transcriptional activator that binds to the C-repeat/DRE，a cis-acting DNA regulatory element that stimulates transcription in response to low temperature and water deficit[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，1997，94（3）：1035-1040.

[7]冯军，郑彩霞. DREB转录因子在植物非生物胁迫中的作用及应用研究[J]. 植物生理学报，2011，47（5）：437-442.

[8]王玉成，杨传平，刘桂丰. DREB 基因的抗逆生理与分子机制研究[C]//东北三省及内蒙古地区遗传学研究进展学术研讨会论文汇编. 北京：中国遗传学会，2009：52.

[9]Liu S X，Wang X L，Wang H W，et al. Genome-Wide analysis of ZmDREB genes and their association with natural variation in drought tolerance at seedling stage of Zea mays L.[J]. PLoS Genetics，2013，9（9）：1003790.

[10]de Paiva Rolla A A，Carvalho J F C，Fuganti-Pagliarini R，et al. Phenotyping soybean plants transformed with rd29A：AtDREB1A for drought tolerance in the greenhouse and field[J]. Transgenic Research，2013，23（1）：75-87.

[11]Kai Z X S H Y. Isolation and characterization of Dehydration-Responsive Element-Binding factor 2C（MsDREB2C） from Malus sieversii Roem[J]. Plant & Cell Physiology，2013，54（10）：585-594.

[12]Kovalchuk N，Jia W，Eini O，et al. Optimization of TaDREB3 gene expression in transgenic barley using cold-inducible promoters[J]. Plant Biotechnology Journal，2013，11（6）：659-670.

[13]Bouaziz D，Pirrello J，Charfeddine M，et al. Overexpression of StDREB1 transcription factor increases tolerance to salt in transgenic potato plants[J]. Molecular Biotechnology，2013，54（3）：803-817.

[14]Jin X F，Xue Y，Wang R，et al. Transcription factor OsAP21 gene increases salt/drought tolerance in transgenic Arabidopsis thaliana[J]. Molecular Biology Reports，2013，40（2）：1743-1752.

[15]Li J，Sima W，Ouyang B，et al. Tomato SlDREB gene restricts leaf expansion and internode elongation by downregulating key genes for gibberellin biosynthesis[J]. Journal of Experimental Botany，2012，63（18）：6407-6420.

[16]Bouaziz D，Pirrello J，Ben A H，et al. Ectopic expression of dehydration responsive element binding proteins（StDREB2）confers higher tolerance to salt stress in potato[J]. Plant Physiology and Biochemistry，2012，60（11）：98-108.

[17]Zhou M L，Ma J T，Zhao Y M，et al. Improvement of drought and salt tolerance in Arabidopsis and Lotus corniculatus by overexpression of a novel DREB transcription factor from Populus euphratica[J]. Gene，2012，506（1）：10-17.

[18]Li M R，Li Y，Li H Q，et al. Improvement of paper mulberry tolerance to abiotic stresses by ectopic expression of tall fescue FaDREB1[J]. Tree Physiology，2012，32（1）：104-113.

[19]Cui M，Zhang W J，Zhang Q，et al. Induced over-expression of the transcription factor OsDREB2A improves drought tolerance in rice[J]. Plant Physiology and Biochemistry，2011，49（12）：1384-1391.

[20]Tang M J，Liu X F，Deng H P，et al. Over-expression of JcDREB，a putative AP2/EREBP domain-containing transcription factor gene in woody biodiesel plant Jatropha curcas，enhances salt and freezing tolerance in transgenic Arabidopsis thaliana[J]. Plant Science，2011，181（6）：623-631.

[21]Peng X J，Ma X Y，Fan W H，et al. Improved drought and salt tolerance of Arabidopsis thaliana by transgenic expression of a novel DREB gene from Leymus chinensis[J]. Plant Cell Reports，2011，30（8）：1493-1502.

[22]Wisniewski M，Norelli J，Bassett C，et al. Ectopic expression of a novel peach（Prunus persica）CBF transcription factor in apple（Malus domestica）results in short-day induced dormancy and increased cold hardiness[J]. Planta，2011，233（5）：971-983.

[23]Wang X E，Chen X F，Liu Y，et al. CkDREB gene in Caragana korshinskii is involved in the regulation of stress response to multiple abiotic stresses as an AP2/EREBP transcription factor[J]. Molecular Biology Reports，2011，38（4）：2801-2811.

[24]Chen J H，Xia X L，Yin W L. Expression profiling and functional characterization of a DREB2-type gene from Populus euphratica[J]. Biochemical and Biophysical Research Communications，2009，378（3）：483-487.

[25]谢登雷，崔江慧，常金华. 高粱中SbDREB2基因的克隆与表达分析[J]. 作物学报，2013，39（8）：1352-1359.

[26]Lucas S，Durmaz E，Akp I I，et al. The drought response displayed by a DRE-binding protein from Triticum dicoccoides[J]. Plant Physiology and Biochemistry，2011，49（3）：346-351.

[27]刘晓颖，陈丽媛，张竞秋，等. 白菜脱水应答转录因子BpDREB1基因的克隆及功能研究[J]. 作物学报，2013，39（2）：230-237.

[28]周永斌，闵东红，徐兆师，等. 不同水分胁迫下转W16小麦回交株系基因表达特性及其抗旱机制[J]. 农业生物技术，2012，20（11）：1271-1281.

[29]翟俊峰，王法微，王南，等. 银中杨DREB基因的克隆及表达[J]. 西北农林科技大学学报：自然科学版，2012，40（6）：79-85.

[30]陈金焕，叶楚玉，夏新莉，等. 胡杨中两个新DREB类基因的克隆、序列分析及转录激活功能研究[J]. 北京林业大学学报，2010，32（5）：27-33.

[31]杨春霞，李火根，程强，等. 南林895杨抗旱耐盐基因DREB1C的转化[J]. 林业科学，2009，45（2）：17-21.

[32]谢健，王啸，冉雪琴，等. 紫花苜蓿DREB1转录因子基因的克隆及序列分析[J]. 畜牧与兽医，2013，45（7）：45-49.

[33]Lee Y E，Yang S H，Bae T W，et al. Effects of field-grown genetically modified Zoysia grass on bacterial community structure[J]. Journal of Microbiology and Biotechnology，2011，21（4）：333-340.

[34]王凭青，李志中，晁跃辉，等. 拟南芥转录因子CBF1基因杂交狼尾草的转化[J]. 重庆大学学报：自然科学版，2007，30（10）：134-137.

[35]Qin F，Kakimoto M，Sakuma Y，et al. Regulation and functional analysis of ZmDREB2A in response to drought and heat stresses in Zea mays L.[J]. The Plant Journal，2007，50（1）：54-69.

[36]Hong B，Ma C，Yang Y J，et al. Over-expression of AtDREB1A in chrysanthemum enhances tolerance to heat stress[J]. Plant Molecular Biology，2009，70（3）：231-240.