糖基化终末产物和磷酸化肌球蛋白轻链在糖尿病结肠动力障碍中的作用*

朱 滢 孙晓萌 王 云 巩尧瑶 林 琳

南京医科大学第一附属医院消化科(210029)

结肠动力障碍是糖尿病(diabetes mellitus，DM)常见慢性并发症之一，约75%的DM患者伴有胃肠动力障碍［1-2］。近年发现，糖基化终末产物(advanced glycation end products，AGEs)在DM患者体内显著升高［3］。目前对AGEs在DM并发症中作用的研究主要集中于DM肾病和心血管病，而对DM胃肠动力障碍方面的研究较少［4-5］。平滑肌是维持胃肠道运动的基础，磷酸化肌球蛋白轻链(phosphorylated myosin light chain，p-MLC)是平滑肌收缩的重要因素［6-7］。研究［8］发现，MLC 信号通路异常在DM血管病变中发挥重要作用，但对DM胃肠动力障碍的作用尚未明确。本文通过探讨DM大鼠结肠组织中MLC磷酸化与结肠动力的关系，以及AGEs对MLC磷酸化的影响，旨在为阐明DM肠道动力障碍提供依据。

材料与方法

一、实验动物和主要试剂

清洁级Sprague-Dawley雄性大鼠16只，5周龄，体质量约150 g，由南京医科大学动物实验中心提供。链脲菌素、生物素-卵血清-HRP复合物、乙酰胆碱购自美国Sigma公司;p-MLC兔抗鼠多克隆抗体、总肌球蛋白轻链(t-MLC)兔抗鼠多克隆抗体购自美国Cell Signaling Technology公司;胎牛血清、DMEM培养液购自美国Gibco公司;AGEs购自美国Merck Millipore公司。

二、实验方法

1.DM动物模型建立:16只大鼠随机分为DM组和正常对照组，每组各8只，DM组参照 Wang等［9］的研究给予单次腹腔注射链脲菌素60 mg/kg建立DM大鼠模型，正常对照组单次腹腔注射等体积柠檬酸缓冲液。一周后检测大鼠尾静脉血糖水平，血糖＞16.7 mmol/L提示造模成功。

2.结肠组织标本采集:参考Wang等［9］的研究于造模8周后以颈椎脱臼法处死DM组和正常对照组大鼠，取大鼠远端结肠组织于4%多聚甲醛固定或－80℃冰箱保存待测。

3.离体结肠肌条肌张力检测:取大鼠结肠组织剥除黏膜层，沿环形肌方向制备成0.2 cm×1 cm肌条，置于 Tyrode缓冲液浴槽(37 ℃、95%O2、5%CO2)，肌条一端固定，一端连接传感器，给予1 g前负荷，平衡1 h，加入1 ×10-3mol/L 乙酰胆碱10 μL，待肌条节律收缩后，记录肌条肌张力变化。

4.免疫组化染色检测结肠组织p-MLC表达:取结肠组织石蜡切片，常规脱蜡、水化，抗原热修复，内源性过氧化物酶阻断剂孵育;滴加p-MLC抗体(1∶150)，4℃孵育48 h;滴加生物素标记的二抗(1∶500)，室温孵育 3 h，滴加生物素-卵血清-HRP复合物(1∶500)，室温孵育3 h;DAB显色，苏木精复染，中性树胶封片。以PBS代替一抗作为阴性对照，以已知阳性切片作为阳性对照。

5.蛋白质印迹法检测结肠组织p-MLC、t-MLC表达:提取结肠组织总蛋白，裂解液冰裂解30 min，以BCA法测定蛋白浓度，取50 μg蛋白行聚丙烯酰胺凝胶电泳，转膜，5%脱脂牛奶封闭1 h，分别加入p-MLC 抗体(1∶500)、t-MLC 抗体(1∶1000)，4 ℃孵育过夜，加入辣根过氧化物酶标记的二抗，37℃孵育1 h，ECL显影，凝胶成像系统拍照、分析。MLC磷酸化水平以p-MLC/t-MLC/β-actin表示。

6.结肠平滑肌细胞(SMCs)分离培养:正常对照组大鼠处死后，距肛门端2 cm处取结肠组织10 cm，以Hepes-Ringer缓冲液反复冲洗，去除黏膜层和浆膜层，剪碎平滑肌组织，加入消化液，1500 r/min离心5 min，以含10%胎牛血清的DMEM培养液重悬细胞、过筛，接种于培养皿于37℃、95%O2、5%CO2条件下培养，待SMCs长至致密单层时，以PBS冲洗，加入无血清的DMEM培养液饥饿培养12 h。

7.蛋白质印迹法检测 SMCs的 p-MLC、t-MLC表达:取SMCs分为AGEs不同浓度处理组和不同时间处理组，前者分别以 AGEs 0、10、50、100 μg/mL干预SMCs 30 min，后者分别以 AGEs 50 μg/mL干预 SMCs 0、15、30、60 min，以蛋白质印迹法检测SMCs的p-MLC、t-MLC表达，实验方法同步骤5。

三、统计学分析

结 果

一、DM模型验证

DM组大鼠血糖均＞16.7 mmol/L，提示造模成功。DM组血糖水平较正常对照组显著升高［(28.12 ±2.33)mmol/L 对(6.92 ± 1.31)mmol/L，P ＜0.01］，体质量显著减低［(368.21 ±12.32)g对(512.62 ±15.44)g，P ＜0.01］。

二、结肠肌条肌张力变化

乙酰胆碱作用后，与正常对照组相比，DM组大鼠结肠平滑肌张力显著减弱［(0.89±0.09)g对(1.98 ±0.12)g，P ＜0.05］。

三、结肠组织p-MLC表达情况

免疫组化染色结果显示，p-MLC阳性染色表达于细胞质，呈棕色颗粒样，主要位于黏膜肌层和肌层。DM组大鼠远端结肠组织p-MLC表达水平较正常对照组减少，以黏膜肌层、环肌层减少最为显著(见图1)。

图1 结肠组织p-MLC表达情况(免疫组化染色，×200)

四、结肠组织MLC磷酸化水平

蛋白质印迹法检测结果显示，与正常对照组相比，DM组大鼠结肠组织p-MLC/t-MLC/β-actin水平显著降低(0.98 ± 0.10 对 1.61 ± 0.12，P ＜ 0.05)(见图2)。

图2 结肠组织p-MLC、t-MLC表达水平(蛋白质印迹法)

五、不同浓度AGEs对SMCs中MLC磷酸化水平的影响

与 AGEs 0 μg/mL 组相比，AGEs 10、50 μg/mL组p-MLC/t-MLC/β-actin水平显著降低 (0.63±0.01、0.45 ±0.02 对 1.05 ±0.03，P ＜0.05)，AGEs 100 μg/mL组与 AGEs 0 μg/mL组间差异无统计学意义(P ＞0.05)(见图3)。

图3 不同浓度AGEs对SMCs中p-MLC、t-MLC表达水平的影响(蛋白质印迹法)

六、不同作用时间AGEs对SMCs中MLC磷酸化水平的影响

与 AGEs 0 min组相比，AGEs 30、60 min组p-MLC/t-MLC/β-actin 水平显著降低(0.26 ±0.04、0.25± 0.02 对 0.92 ± 0.05，P ＜ 0.05)。AGEs 15 min组与AGEs 0 min组间差异无统计学意义(P ＞0.05)(见图4)。

图4 不同作用时间AGEs对SMCs中p-MLC、t-MLC表达水平的影响(蛋白质印迹法)

讨 论

DM结肠动力障碍表现为结肠张力和收缩力降低、蠕动减慢、排空延迟［10］。平滑肌是胃肠运动的基础，平滑肌收缩功能改变与DM结肠动力障碍密切相关。本研究结果显示，DM大鼠结肠平滑肌张力减低，证实DM大鼠伴有结肠动力障碍。同时发现结肠组织p-MLC表达减少，MLC磷酸化水平减低，表明DM大鼠结肠动力障碍由p-MLC减少所致。进一步行离体细胞实验发现，AGEs可抑制SMCs发生MLC磷酸化。上述研究提示DM患者结肠动力障碍与其体内AGEs水平升高，抑制SMCs MLC磷酸化，从而减弱结肠平滑肌张力有关。

AGEs是蛋白质和脂类经非酶糖基化后生成的含多种结构分子的混合物，AGEs可通过受体依赖性和受体非依赖性途径促进DM并发症发生［11］，其不仅与蛋白质结合，亦可通过与核酸、脂质结合，参与DM并发症形成。此外，AGEs可激活一系列信号通路，促进炎性因子、氧化产物生成增加，导致组织器官损伤，在DM并发症中发挥重要作用［12-13］。本研究发现AGEs可抑制SMCs的MLC磷酸化，从而影响结肠平滑肌张力，然而由于尚不明确AGEs的特异性受体拮抗剂，因此未能证明AGEs作用的相关信号通路。

MLC磷酸化是决定平滑肌收缩的重要因素，其可缩短肌动蛋白与肌球蛋白间的横桥周期，引起平滑肌收缩。MLC磷酸化受肌球蛋白轻链激酶(MLCK)正向调节和肌球蛋白轻链磷酸酶(MLCP)负向调节，后者使其去磷酸化，从而导致平滑肌松弛［14-16］。研究［17-18］显示，DM大鼠幽门、回肠动力减弱伴MLCK表达减少;DM大鼠尾动脉收缩功能减弱伴p-MLC表达减少;DM兔膀胱平滑肌收缩功能减弱伴p-MLC表达升高，提示p-MLC和MLCK在不同组织中的表达水平和作用效应有所不同，相关机制需进一步研究。本研究证实DM大鼠结肠动力障碍伴有结肠组织p-MLC表达减少，但未进一步研究MLCK和MLCP在此过程中的作用，拟在后续研究中阐明。

综上所述，本研究发现，DM大鼠结肠动力障碍可能由AGEs抑制SMCs中的MLC磷酸化所致。然而，此过程中仍有部分机制未完全明了，如AGEs降低p-MLC表达的信号通路，MLCK、MLCP对p-MLC的调节效应等，有待未来进一步研究深入探讨。

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